Transduction and selection of hematopoietic stem cells for gene therapy of hemoglobin disorders = = Transduction et sélection des cellules souches hématopoïétiques pour la thérapie génique des maladies de l'hémoglobine : / Kanit Bhukhai ; sous la direction de Philippe Leboulch et Emmanuel Payen

Date :

Editeur / Publisher : [Lieu de publication inconnu] : [éditeur inconnu] , 2015

Type : Livre / Book

Type : Thèse / Thesis

Langue / Language : anglais / English

Catalogue Worldcat

Cellules souches hématopoïétiques

Hémoglobinopathie -- Thérapeutique

Lentivirus

bêta-Thalassémie -- Dissertation universitaire

Thérapie génique

Thérapeutique cellulaire

Leboulch, Philippe (Directeur de thèse / thesis advisor)

Payen, Emmanuel (Directeur de thèse / thesis advisor)

École doctorale Hématologie, oncogenèse et biothérapies (Paris ; 2014-....) (Ecole doctorale associée à la thèse / doctoral school)

Université Sorbonne Paris Cité (Organisme de soutenance / degree-grantor)

Université Paris Diderot - Paris 7 (1970-2019) (Autre partenaire associé à la thèse / thesis associated third party)

Résumé / Abstract : Lors d'essais cliniques réalisés chez des patients atteints de maladies génétiques du système hématopoïétique, il fut démontré que la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) modifiées par des vecteurs intégratifs apportait un bénéfice thérapeutique. Cependant parfois, des niveaux de correction limités n'apportèrent qu'un bénéfice restreint. Dans le but d'obtenir des niveaux élevés de CSH génétiquement modifiées sans augmenter le risque de mutagenèse insertionnelle de manière inconséquente, nous avons développé des systèmes de sélection des CSH, transduites par des vecteurs lentiviraux codant une protéine de résistance à un antibiotique ou protégeant l'ADN contre des agents alkylants. Nous avons introduit ces gènes dans un vecteur exprimant le gène [3-globine capable de corriger les cellules de patients 3-thalassémiques. L'évaluation in vitro du vecteur portant la protéine déalkylante nous suggéra que son expression était trop faible pour protéger efficacement les cellules transduites. Au contraire, le vecteur (3-globine portant le gène de résistance à la puromycine nous permit de sélectionner les cellules souches hématopoïétiques génétiquement modifiées de manière optimale. Une fois sélectionnées ex vivo, les CSH étaient capables de reconstituer l'hématopoïèse humaine dans des souris immunodéficientes. Par ailleurs, les cellules érythroïdes pouvaient exprimer le gène 3-globine à un niveau compatible avec la correction du phénotype des cellules de patients 3-thalassémiques. Nous avons également introduit un gène suicide dans le vecteur, fonctionnel et capable d'éliminer les cellules hématopoïétiques génétiquement modifiées en cas de nécessité.

Résumé / Abstract : Recent clinical trials conducted in patients with hematopoietic congenital diseases have demonstrated the potential benefit of autologous hematopoietic stem cell (HSC) transplantation combined with gene transfer using integrative lentiviral vectors. However, the level of transduced HSCs was occasionally non optimal, resulting in partial correction of the diseases. In order to achieve high level HSC modification without increasing the concurrent risk of insertional mutagenesis and oncogene activation, we decided to develop methods aimed at selecting genetically modified stem cells rather than increasing their initial transduction rate. In order to demonstrate the feasibility of our approach, drug resistance genes encoding an antibiotic resistant protein or a dealkylating agent were introduced, together with a suicide gene, in a clinical 3-globin lentiviral vector specifically designed for patients with hemoglobin disorders. In vitro evaluation made with a vector encoding the dealkylating protein suggested that its expression was too low to provide full protection to the cells. lnterestingly, we demonstrated that the puromycin resistant gene allowed optimal ex vivo selection of genetically modified puromycin treated human HSC, provided that P-gp transporter inhibitors were added to the cells. Once selected, transduced HSC survived and were able to reconstitute human hematopoiesis in immunodeficient animal. Furthermore, the vector was able to express the therapeutic [3- globin gene for correction of hemoglobin disorders and to produce the suicide protein in vivo, for elimination of transduced stem cells if necessary.