Date : 2009
Editeur / Publisher : [Lieu de publication inconnu] : [éditeur inconnu] , 2009
Type : Livre / Book
Type : Thèse / ThesisLangue / Language : français / French
Résumé / Abstract : Dans le domaine du diagnostic in vitro, l’élaboration de biopuces à ADN utilisant des méthodes électrochimiques suscite un vif intérêt. L’électrochimie est une technique sensible et adaptée aux microsystèmes de multidétection. L’objectif de ce travail a été d’élaborer de nouvelles sondes oligonucléotidiques modifiées par un grand nombre de ferrocènes et d’étudier leur réponse électrochimique en présence d’une cible ADN. Une première catégorie d’oligonucléotides (ODN) structurés sous forme tige-boucle a été étudiée. De 2 à 8 ferrocènes ont été incorporés, soit entre tige et boucle, soit aux extrémités de la séquence. Une autre catégorie d’ODN a été obtenue par oxydation amidative de liens H-phosphonates par des ferrocènes aminés. La combinaison de liens phosphodiesters et H-phosphonates a permis l’incorporation de 3 ou 5 ferrocènes dans la séquence. Cette chimie a été préférentiellement accomplie sur des ODN d’anomérie α afin de maintenir une bonne stabilité des duplex formés avec les séquences complémentaires. Des études thermodynamiques menées sur les différentes structures ont montré que, i) les ferrocènes ne modifiaient pas de façon importante les propriétés d’hybridation des structures tige-boucle, ii) en série α, les ferrocènes positionnés sur les phosphoramidates ne gênaient pas l’hybridation. La réaction d’hybridation a alors été étudiée en CV et en DPV. Une première étude menée avec les sondes en solution a permis de montrer une forte diminution de Iox et une augmentation de ΔE en présence de la cible complémentaire. Après greffage des sondes tige-boucle sur une biopuce à électrodes d’or, un seuil de détection de 200 pM a été atteint
Résumé / Abstract : In the field of in vitro diagnostics, the conception of DNA microarrays using electrochemical methods is of growing interest. Electrochemical technics are sensitive and well adapted to biochip integration in fluidic systems. The goal of this work was to modify new oligonucleotide probes (ODN) with a high number of ferrocene moieties and to study their electrochemical response upon hybridization with a DNA target. Two different types of ODN were elaborated. The first one consisted of modified stem-loop structures (hairpins) with numerous ferrocenes, from 2 to 8 molecules, either between the stem and loop or at the stem extremities of the sequence. Thermodynamic studies achieved on the modified structures proved the low destabilization effect of ferrocene moieties on hairpin folding and duplex formation with the complementary sequence. The second design was elaborated by achieving an amidative oxidation reaction with ferrocenyl amines on H-phosphonate internucleosidic linkages of an oligonucleotide. 3 or 5 ferrocenes were incorporated in the sequence by mixing phosphodiester and H-phosphonate bonds. This chemistry was preferentially accomplished with α-anomeric ODN in order to stabilize duplexes with the complementary target. Thermodynamic studies confirmed the stability of duplexes formed with ferrocenyl α-anomeric sequences. Then, hybridization reaction was studied by CV and DPV with the two probe designs. A first study performed with probes in solution showed a high decrease of Iox and a high increase of ∆E with complementary target. A detection limit of 200 pM was found after immobilization of some ferrocene modified hairpins on the gold electrodes of a microarray