High-pressure effects on proteins and the volume change upon unfolding / Julien Roche ; sous la direction de Christian Roumestand

Date :

Type : Livre / Book

Type : Thèse / Thesis

Langue / Language : anglais / English

Dynamique moléculaire

Protéines -- Repliement

Spectroscopie de fluorescence

Roumestand, Christian (1958-....) (Directeur de thèse / thesis advisor)

Radulescu, Ovidiu (19..-....) (Président du jury de soutenance / praeses)

Van Heijnoort, Carine (Rapporteur de la thèse / thesis reporter)

Blackledge, Martin (19..-....) (Rapporteur de la thèse / thesis reporter)

Robert, Bruno (19..-....) (Membre du jury / opponent)

Université des sciences et techniques de Montpellier 2 (1970-2014) (Organisme de soutenance / degree-grantor)

Rensselaer Polytechnic Institute (Troy, New York (Etats-Unis)) (Organisme de cotutelle / degree co-grantor)

Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; ....-2014) (Ecole doctorale associée à la thèse / doctoral school)

Centre de biochimie Structurale (Montpellier) (Laboratoire associé à la thèse / thesis associated laboratory)

Résumé / Abstract : Afin de lever le mystère centenaire qui entoure l'origine du changement de volume associé au dépliement des protéines globulaires, nous avons constitué une collection de 10 mutants du variant hyperstable de la SNase, ∆+PHS. Chacune de ces mutations a été conçue pour créer une nouvelle cavité ou agrandir une cavité existante au sein de la protéine. Dans un premier temps, nous avons analysé comment l'environnement structural local conditionne l'adaptation à la mutation. Les expériences de fluorescence sous haute pression ont montré un accroissement systématique de la différence de volume entre les états replié et déplié pour les 10 variants par rapport à ∆+PHS. Ce résultat majeur, qui s'ajoute à une étude récente démontrant que les effets d'hydratation ne contribuent pas de manière significative au changement de volume, démontre sans ambiguïté que la différence de volume entre les états replié et déplié est principalement due à la présence de cavités internes dans la structure native des protéines. Les mesures par RMN des changements de volume ont permis d'établir une cartographie des effets de la pression à l'échelle du résidu et d'identifier les intermédiaires de repliement peuplant le paysage énergétique. En analysant les cinétiques de dépliement, nous avons finalement pu caractériser les conséquences de ces mutations sur les états de transitions de la SNase.

Résumé / Abstract : To solve the century-old question of the origin of the volume change upon unfolding for globular proteins, we built up a collection of 10 mutants of the hyperstable variant of SNase, ∆+PHS. Each of these mutations was designed to create a cavity or to enlarge a naturally occurring cavity in the protein core. We first analyzed how the local structural environment determines the adaptation to the mutation. The high-pressure fluorescence experiments showed a systematic increase of the volume difference between the folded and unfolded states for the 10 variants, compared to ∆+PHS. This major result, in addition to a recent study demonstrating that the hydration effects do not provide any significant contribution to the volume changes, clearly demonstrates that the volume difference between the folded and unfolded states is predominantly due to the presence of internal cavities in the native structure. NMR measurements of the volume change allowed a mapping of the pressure effects on a residue scale and the identification of the folding intermediates populating the free-energy landscape. By analyzing the unfolding kinetics, we finally characterized the consequences of these mutations on the transition state ensembles of SNase.