Date : 2006
Editeur / Publisher : [S.l.] : [s.n.] , 2006
Type : Livre / Book
Type : Thèse / ThesisLangue / Language : français / French
Hypermutation somatique des gènes des immunoglobulines
Protéines à fluorescence verte
Résumé / Abstract : L'hypermutation somatique (HMS) consiste en l'introduction de mutations ponctuelles dans les régions variables des immunoglobulines. Différents travaux ont suggéré que les mutations dans les gènes V seraient introduites lors de la réparation des cassures doubles brins. Afin d'évaluer cette hypothèse, nous avons utilisé la capacité de la TdT (terminale transférase) à incorporer des nucléotides sur des extrémités 3'OH de l'ADN laissant ainsi des cicatrices aux sites de cassures. Les résultats de nos travaux réalisés avec des souris TdT transgéniques montrent que même si des séquences N ont été mises en évidence au niveau des jonctions VJ des chaînes légères, aucune insertion N n'a été trouvée dans les régions V remettant ainsi en cause l'implication des cassures double brin dans l'HMS. Afin de mieux comprendre le mécanisme moléculaire de l'HMS, nous avons développé un modèle utilisant des vecteurs épisomiques nous permettant de distinguer les mutations G:C et A:T. Les mutations G:C correspondent à la phase I d'HMS et résultent directement de la déamination des cytidines par l'AID (activation induced cytidine deaminase), l'enzyme clé de l'HMS. Le mécanisme des mutations A:T (phase II de l'HMS) impliquent en plus de l'AID les facteurs de réparations des mésappariements mais n'est pas encore élucidé. En utilisant une série de vecteurs contenant le gène GFP inactivé par des codons STOP en différentes positions, nous avons évalué le niveau et le profil d'HMS de plusieurs lignées cellulaires. La mise en évidence de mutations A:T AID-dépendantes dans les cellules non B suggère que AID serait le seul facteur B-spécifique nécessaire pour déclencher les mutations au niveau des paires A:T.
Résumé / Abstract : Somatic hypermutation (SHM) consists in introducing point mutations into the variable region of the rearranged immunoglobulin genes. A series of works proposed that in SHM the mutations would be introduced during the repair of double-strand breaks (DSB) within V genes. Taking opportunity of the availability of the TdT transgenic mice, that constitutively express TdT in ail B lineage cells, we have used a strategy exploiting the capacity of the TdT to add nucleotides on 3'OH DNA ends to detect DSN in V genes, if any. Our results show that although TdT activity could be evidenced at DSB of VJ junctions, no TdT insertions were detected in the V genes, suggesting that DSB are dispensable for the generation of mutations during SHM. In order to better understand the molecular mechanism of SHM we have developed a model using episomic vectors that enables us to distinguish between G:C and A:T mutations. G:C mutations correspond to the first phase of SHM resulting directly from the activity of AID (activation induced cytidine deaminase), the key enzyme of SHM, while AT mutations, which correspond to the second phase, implicate also the mismatch repair proteins, but the exact mechanism remains to be elucidated. A set of vectors containing a GFP gene, inactivated by the introduction of different STOP codons at various positions of the gene, was used to detect the hypermutation level of AID expressing cell lines. The existence of AID dependent A:T mutations detected by episomic vectors in a non B cell line suggests that AID is the only B specific factor necessary for triggering AT focused mutations.