Date : 2020
Type : Livre / Book
Type : Thèse / ThesisLangue / Language : français / French
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Résumé / Abstract : Les hélicases réplicatives sont des enzymes essentielles qui assurent la séparation des deux brins d’ADN pendant la réplication et la processivité de la synthèse de l’ADN. La charge de l’hélicase réplicative est une étape critique de l’initiation de la réplication. Dans les organismes modèles, dans l’étude de la réplication bactérienne (Escherichia coli et Bacillus subtillis), il a été montré que cette étape est assurée par des facteurs protéiques, nommés « chargeurs d’hélicase ». Cependant, fort peu d’organismes possèdent les gènes spécifiant ces protéines. Une étude phylogénomique a montré que, la très grande majorité des génomes bactériens possèdent à la place un autre gène, ancestral, essentiel, sans lien d’homologie avec les chargeurs d’hélicase et de fonction inconnue à ce jour. Nous avons nommé ce gène dciA. Cette étude a également montré que dciA a été éliminé à plusieurs reprises au cours de l’évolution et systématiquement remplacé par un gène de chargeur d’hélicase phagique. Ces résultats, suggérant que DciA pourrait être un chargeur d’hélicase, nous a conduit à initier la caractérisation fonctionnelle de DciA. Une propriété importante distingue catégoriquement les hélicases des organismes possédant DciA de celles des organismes possédant un chargeur d’hélicase. Les hélicases réplicatives des organismes possédant DciA sont capables de se charger de façon autonome sur l’ADN - c’est-à-dire sans chargeur d’hélicase - in vitro et in vivo. En parallèle, nous avons montré que DciA stimulait la charge de l’hélicase réplicative sur l’ADN in vitro et que DciA était essentielle et spécifiait une fonction critique pendant l’initiation de la réplication in vivo. Nous montrons par des analyses de cytométrie en flux que le rythme et la synchronie des initiations de la réplication sont affectés par l’absence de DciA. L’analyse de la fréquence de marqueurs génomiques (MFA) dans des cellules dciA⁻ confirme que l’initiation de la réplication est altérée et suggère une charge partielle des hélicases à l’origine de réplication. Ainsi, DciA pourrait contribuer à la mise en place d’une réplication bidirectionnelle de l’ADN en aidant à synchroniser la charge des 2 hélicases réplicatives, soit en favorisant l’adoption par l’hélicase d’une conformation compétente pour la charge, soit en assurant la charge coordonnée des 2 hélicases à l’origine de réplication du chromosome. Des résultats génétiques et structuraux à l’appui de cette hypothèse sont présentés.
Résumé / Abstract : Replicative helicases ensure DNA unwinding during replication and the processivity of DNA synthesis. The loading of the helicase during replication initiation is critical. In the model organisms (Escherichia coli and Bacillus subtilis), this step was shown to depend on designated “helicase loaders”. Yet, only a limited amount of species contains the genes encoding these proteins. In a phylogenomic study, it was shown that most bacterial species contain instead an ancestral and essential gene of unknown function. We named this gene, dciA. The same study revealed the existence of several bacterial clades in which dciA was lost through evolution and systematically replaced by a helicase loader gene of phage origin. These results that suggested that DciA might also be a helicase loader led us to investigate the functional characterization of DciA. We established that helicases of DciA-type organisms could self-load on DNA in vitro and in vivo. This property contrasts with the strict requirement for a helicase loader to place the helicase on DNA in organisms encoding a helicase loader and questions the function of DciA. We showed that DciA stimulated the loading of the helicase in vitro and that DciA specified an essential and critical function during replication initiation in vivo. We showed by flow cytometry analyses that replication initiation timing and synchrony were perturbed in absence of DciA. Marker frequency analyses (MFA) of dciA⁻ cells confirmed the cytological data and suggested that replicative helicases were only partially loaded at the origin of replication of the chromosome. Supporting genetic and structural data are presented.