Date : 2011
Type : Livre / Book
Type : Thèse / ThesisLangue / Language : français / French
Résonance magnétique nucléaire biomoléculaire -- Dissertation universitaire
Structure secondaire des protéines -- Dissertation universitaire
Système acellulaire -- Dissertation universitaire
Protéines membranaires -- Dissertation universitaire
Protéines Escherichia coli -- Dissertation universitaire
Collection : Lille-thèses / Atelier de reproduction des thèses / Lille : Atelier national de reproduction des thèses , 1983-2017
Résumé / Abstract : Le canal mécanosensible à large conductance MSCL d'escherichia coli est une proteine de la membrane interne de la bactérie. L'activité de cette protéine est fortement dépendante de la membrane ; le canal s'ouvre lorsque la pression au niveau de la membrane augmente, lors d'un choc hypoosmotique, relarguant de l'eau et différents substrats afin que la bactérie retrouve un état osmotique adéquat à sa survie. Il est donc essentiel de recueillir de données structurales de la protéine dans son environnement natif. Nous proposons un étude structurale de la protéine par résonance magnétique nucléaire en phase solide. La surexpression de la protéine et son marquage aux isotopes 13c et 15n sont deux étapes clé d'un tel projet. Une surexpression bactérienne et un marquage uniforme de la protéine ont été effectués. Les données spectrales obtenues montrent une bonne résolution, mais l'imbrication des corrélations ne permet pas d'en extraire des données structurales. Afin de réduire le nombre de résidus marqués, un marquage spécifique a été appliqué par synthèse vitro. Le premier test a montré que l'approche permettait de réduire le temps d'acquisition tout en diminuant la quantité d'informations. Différentes méthodes ont ensuite été appliquées pour trouver les combinaisons d'acides aminés à marquer spécifiquement en synthétisant la protéine in vitro. Ces approches utilisent les programmes de prédiction de déplacements chimiques ou l'analyse de la séquence à la recherche de paires d'acides aminés uniques. Une approche combinatoire a été testée. Les échantillons synthétisés ont montre une bonne résolution et ont permis l'identification de plusieurs corrélations
Résumé / Abstract : Membrane proteins account for almost 30% of the proteome and play essential roles in many cellular mechanisms. The mechanosensitive channel of large conductance mscl is an intrinsic membrane protein of the inner membrane of escherichia coli. This protein acts as a valve pressure, in a hypo-osmotic down-shock, to prevent the bacterial lysis. In this work, a study of the structural characteristics of mscl in its native environment, the lipid bilayer, by nuclear magnetic resonance in the solid-state is presented. A major problem in determining the three-dimensional structure of membrane proteins by this technique is their overexpression and the analysis of carbon-carbon correlations from uniformly labelled samples. The analysis of mscl by solid-state nmr with a uniform labelling showed spectra with a good resolution, but the overlapping of the correlations prevented any identification or assignment of the residues. We showed that selective labelling of the membrane protein mscl by using cell-free synthesis represents a crucial help in improving data sets obtained by nmr in the solid-state. Singe the amino acids chemical shifts show a big overlapping, different strategies to choose specific labelling patterns to cet well-resolved spectra were developed. These strategies are based on chemical shifts prediction, or sequence analysis to isolate unique amino acid pairs. A combined approach was testee. These different approaches showed spectra with a good resolution, and facilitated the identification of amino acids in some cases