Multiplexed Genetic Perturbations of the Regulatory Network of E. coli. / Matthew Deyell ; sous la direction de Andrew Griffiths et de Philippe Nghe

Résumé / Abstract : Malgré les progrès réalisés dans le séquençage de l’ADN, nous n’avons pas encore compris comment le phénotype d’un organisme se rapporte au contenu de son génome. Cependant, il est devenu clair que l'impact des gènes dépend du contexte. La simple présence d'un gène dans un génome ne nous informe pas du moment où il est exprimé et des autres gènes qui y sont exprimés. Comprendre comment l'expression des gènes est régulée est un élément nécessaire pour comprendre comment les phénotypes émergent d'un génotype donné. Les facteurs de transcription, qui peuvent activer ou réprimer l'expression d'un gène, forment un réseau complexe d'interactions entre eux et leurs gènes ciblés. Ce réseau consiste en une hiérarchie de groupes de facteurs de transcription fortement liés, chacun lié à des processus cellulaires distincts. La structure de ce réseau de régulation transcriptionnelle est-elle significative pour la réponse transcriptionnelle d'une cellule? Ici, nous utilisons une protéine de liaison à l'ADN programmable appelée CRISPR (répétitions courtes palindromiques groupées régulièrement) pour perturber l'expression génique des régulateurs globaux au sein du réseau de régulation transcriptionnelle. Ces régulateurs mondiaux régulent de nombreux processus cellulaires distincts et ont de nombreuses cibles génétiques. Le système CRISPR nous permet de perturber ces régulateurs dans toutes les combinaisons possibles, y compris les perturbations d'ordre supérieur avec tous les régulateurs mondiaux potentiellement ciblés perturbés en même temps. Nous enregistrons ensuite à la fois le modèle d'expression du transciptome en utilisant le séquençage de l'ARN et l'adéquation de chaque souche. Nous trouvons que la structure du réseau de régulation augmente la dimensionnalité de la réponse transcriptionnelle plutôt que de la réduire. Cela se traduit par une épistasie importante au-delà des interactions par paires. Cela a des implications sur la façon dont ces réseaux évoluent. L'épistasie par paires que nous trouvons entre les facteurs de transcription globaux repose sur la présence ou l'absence d'autres perturbations. Cela implique que d'autres perturbations pourraient agir comme des mutations de potentialisation. Le nombre de voies d'évolution potentielles augmente avec les épistasies d'ordre élevé, même si cela ne nous dit rien sur la qualité de ces voies. Fait important, les répliques de cette thèse sont toujours en cours et les données présentées ici n’ont pas encore exclu les artefacts expérimentaux.

Résumé / Abstract : Despite advances in DNA sequencing, we have yet to understand how an organism’s phenotype relates to the contents of their genome. However it has become clear that the impact of genes are context dependant. The mere presence of a gene within a genome does not inform us of when it is expressed, and which other genes are expressed along with it. Understanding how gene expression is regulated is a necessary piece of understanding how phenotypes emerge from a given genotype. Transcription factors, which can activate or repress the expression of a gene, form a complex network of interactions between themselves and their targeted genes. This network consists of a hierarchy of groups of strongly connected transcription factors, each relating to distinct cellular processes. Is the structure of this transcriptional regulatory network significant to the transcriptional response of a cell? Here we use a programmable DNA binding protein called CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) to perturb gene expression of global regulators within the transcriptional regulatory network. These global regulators are regulating many distinct cellular processes and have many genetic targets. The CRISPR system allows us to perturb these regulators in all possible combinations, including higher order perturbations with potentially all targeted global regulators perturbed at the same time. We then record both the expression pattern of the transciptome using RNA sequencing, and the fitness of each strain. We find that the structure of the regulatory network increases the dimensionality of the transcriptional response rather than reducing it. This results in significant high order epistasis beyond pair-wise interactions. This has implications for how these networks evolve. The pair-wise epistasis we find between global transcription factors rely on the presence or absence of other perturbations. This implies that other perturbations could act as potentiating mutations. The number of potential evolutionary paths increases with high order epistasis, although this alone tells us nothing about the quality of those paths. Importantly, the replicates for this thesis are still on-going and the data presented here has not yet excluded experimental artefacts.