Development and validation of kinase activity reporters for the dynamical study of cell response modalities by microscopy : Role of the Mitogen-Activated Protein Kinase / Extracellular signal-Regulated Kinase in necroptosis / François Sipieter ; sous la direction de Katia Cailliau et de Peter Vandenabeele et de Franck Riquet et de Laurent Héliot

Date :

Type : Livre / Book

Type : Thèse / Thesis

Langue / Language : anglais / English

Langue / Language : français / French

MAP kinase

Protéines kinases

Mort cellulaire

TNF-alpha

Sondes fluorescentes

Dynamique moléculaire

Transduction du signal cellulaire

Microscopie de fluorescence

Classification Dewey : 571.939

Cailliau, Katia (1966-....) (Directeur de thèse / thesis advisor)

Vandenabeele, Peter (Directeur de thèse / thesis advisor)

Riquet, Franck (Directeur de thèse / thesis advisor)

Héliot, Laurent (Directeur de thèse / thesis advisor)

Université Lille 1 - Sciences et technologies (Villeneuve-d'Ascq ; 1970-2017) (Organisme de soutenance / degree-grantor)

Universiteit Gent (Organisme de cotutelle / degree co-grantor)

École doctorale Biologie-Santé (Lille) (Ecole doctorale associée à la thèse / doctoral school)

Unité de glycobiologie structurale et fondamentale (UGSF) (Laboratoire associé à la thèse / thesis associated laboratory)

Laboratoire de Physique des Lasers, Atomes et Molécules (PhLAM) (Laboratoire associé à la thèse / thesis associated laboratory)

Résumé / Abstract : La nécroptose est une mort programmée caspase indépendante, induite par le Tumor Necrosis Factor alpha (TNFα) et fait intervenir une voie de signalisation impliquant deux kinases, les Receptor-Interacting Protein Kinases 1 et 3 (RIPK1 et RIPK3) et la pseudo-kinase Mixed Lineage Kinase domain-Like protein (MLKL). L’activation des kinases Extracellular signal-Regulated Kinase 1 et 2 (ERK1/2) a été rapportée dans plusieurs morts cellulaires programmées. Par ailleurs, la régulation de l’activité de ERK1/2 en termes d’amplitude, de durée et de localisation via des régulateurs spatio-temporels spécifiques est nécessaire pour l’orientation du destin cellulaire. L’inhibition de ERK1/2 retarde la nécroptose induite par le TNFα dans les L929 de manière dose-dépendante, sans pour autant la bloquer, suggérant un rôle pro-nécrotique de ERK1/2. Dans ces conditions expérimentales, une activité biphasique et compartimentée de ERK1/2 a été observée. De plus, nos résultats indiquent que la phosphorylation ERK1/2 est RIPK1 dépendante. Nous avons développé un nouveau rapporteur de localisation de ERK2, appelé ERK2-LOC. Une translocation transitoire suivi d’une accumulation nucléaire de ERK2 suite à la stimulation des L929 par le TNFα a été observée. Les mesures d’activité de ERK1/2 au cours de la nécroptose ont été réalisées avec un biosenseur FRET d’activité kinase (ERK1/2-ACT). Son utilisation a révélé une signature spatio-temporelle spécifique d’activité au cours de la nécroptose. Afin de corréler les signatures d’activité de ERK1/2 avec celles des kinases RIPK1 et RIPK3, nous avons développé une première génération de biosenseurs FRET pour ces kinases initiatrices de la nécroptose.

Résumé / Abstract : Necroptosis is defined as a caspase-independent programmed cell death and relies on a signaling pathway involving two serine-threonine kinases: Receptor-Interacting Protein Kinase 1 and 3 (RIPK1 and RIPK3) and the pseudo-kinase Mixed-Lineage Kinase Like (MLKL). Activation of Extracellular signal-Regulated Kinases 1 and 2 (ERK1/2) was reported to be involved in different modes of programmed cell death. It is now accepted that the regulation of the duration, magnitude and subcellular compartmentalization of ERK1/2 activity by specific spatio-temporal regulators is interpreted by the cell towards cell fate determination. ERK1/2 inhibition delays TNFα-induced necroptosis in L929 cells in a dose dependent manner but did not block it, providing arguments for a pro-necrotic function of ERK1/2. In this context, a compartmentalized biphasic phosphorylation of ERK1/2 was observed. Our results indicate a RIPK1-dependent phosphorylation of ERK1/2. Owing to the importance of ERK1/2 spatio-temporal dynamics in determining cellular responses, we developed a new reporter of ERK2 localization named ERK2-LOC. We observed a transient translocation of ERK2 when necroptosis was triggered in L929 upon TNFα stimulation, followed by progressive ERK2 accumulation in the nucleus. ERK1/2 activities were monitored during necroptosis using a FRET-based kinase biosensor for ERK1/2 (ERK1/2-ACT). Using ERK1/2-ACT, a dedicated spatio-temporal signature of ERK1/2 activity was recorded during necroptosis. Finally, to correlate ERK1/2 activity code with necroptosis occurrence, we also engineered a first generation of FRET biosensors to report on both RIPK1 and RIPK3 activities during necroptosis.