Date : 2014
Editeur / Publisher : [S.l.] : [s.n.] , 2014
Type : Livre / Book
Type : Thèse / ThesisLangue / Language : anglais / English
Liposomes unilamellaires -- Dissertation universitaire
Électrophysiologie -- Dissertation universitaire
Techniques de patch-clamp -- Dissertation universitaire
Capacité électrique -- Dissertation universitaire
Biomimétique -- Dissertation universitaire
Résumé / Abstract : Les Vésicules Unilamellaires Géantes (GUVs) constituent un système modèle biomimétique populaire pour l'étude des principes biophysiques en biologie cellulaire mais pas encore pour celle des effets des potentiels transmembranaires. La technique de "whole cell" patch-clamp est couramment utilisée pour manipuler les potentiels tansmembranaires dans les cellules. Sa simple adaptation à des GUVs ("whole GUV") n'est pas possible à cause de la forte adhésion lipide-verre nécessaire pour l'étanchéité électrique, ce qui entraîne une reptation de la GUV à l'intérieur de la pipette après rupture du patch. Dans cette thèse, j'ai réalisé une configuration "whole GUV" qui est stable et fiable en encapsulant de la bêta-caséine dans les GUVs, pour contrôler l'adhérence au verre de la membrane tout en maintenant un "gigaseal". Ce système permet aussi de contrôler la solution interne de la GUV pour établir des gradients de sel, et de manipuler de la tension de la membrane. Cette méthode nous a permis de mesurer la capacitance de différentes membranes (contenant des lipides chargés ioniques et zwitterioniques, saturés ou insaturés et du cholestérol) en l'absence de contamination. Nous avons également montré que cette méthode peut permettre de caractériser la fluorescence de marqueurs dépendant du voltage. Finalement, la configuration whole GUV a été appliquée à un canal ionique potassium-sélectif, KvAP, reconstitué de manière homogène dans la GUV à l'aide d'un nouveau procédé. Bien que le canal présente une activité dans les patchs excisés, aucune activité n'a pu être détectée dans la configuration "whole GUV", ce qui conduit à de nouvelles hypothèses pour l'activation de KvAP.
Résumé / Abstract : Giant unilamellar vesicles (GUVs) are a popular biomimetic model system for the investigation of biophysical principles of life yet applying a transmembrane potential remains a challenge. A commonly-used strategy to manipulate transmembrane potentials in cells is 'whole cell' patch clamping. A naive adaptation of the whole cell configuration to GUVs ('whole GUV') however is inherently unstable because the strong lipid-glass adhesion necessary for the electrical sealing leads to a crawling of the GUV inside the pipette after gaining access to the GUV interior. Here it is shown that the 'whole GUV' configuration can be stably and reliably achieved by encapsulating beta-casein in GUVs to control the lipid glass adhesion in the whole GUV configuration while maintaining a gigaseal. The configuration allows to control the internal buffer of the GUV (e.g. for a salt gradient) and allows manipulation of the membrane tension. The whole GUV conformation was characterized with GUVs containing charged and zwitter ionic, saturated and unsaturated lipids and cholesterol without organic solvent contamination. The specific capacitance of the membrane was measured and found to scale with the membrane thickness. It was also shown that a voltage sensitive dye can be used to spatially resolve the membrane potential. Eventually, the whole GUV configuration was applie to a potassium selective ion channel, KvAP, reconstitued in the GUV using a new method to obtain GUVs with a homogeneous density distribution. Although the channel shows activity in excised membrane patches, no activity was detected in the whole GUV configuration yet, leading to new hypothesis for KvAP activation.