Date : 2013
Editeur / Publisher : [S.l.] : [s.n.] , 2013
Type : Livre / Book
Type : Thèse / ThesisLangue / Language : français / French
Résumé / Abstract : Des connexions entre la réponse aux dommages à l'ADN et le métabolisme de l'ARN ont récemment été mises en évidence. Mon équipe a identifié une protéine de liaison à l'ARN, SAF-A/hnRNP U, comme un substrat de la DNA-PK, kinase clé de la réparation des cassures double-brin de l'ADN. J'ai étudié l'implication de SAF-A dans la réponse aux dommages de l'ADN. Après micro-irradiation laser, SAF-A-GFP est recrutée transitoirement sur le site de dommage avant d'en être exclue. Ces deux phases sont indépendantes. Le recrutement de SAF-A dépend de PARP, tandis que son exclusion dépend d'ATM, d'ATR et de la DNA-PK. Le domaine de liaison à l'ARN de SAF-A reproduit la dynamique de SAF-A. Ce domaine interagit majoritairement avec des protéines de liaison à l'ARN, dont FUS et TAF15, qui présentent une dynamique similaire. L'inhibition de la transcription abolit la phase d'exclusion de SAF-A, suggérant que l'exclusion concerne la fraction de SAF-A engagée dans la transcription. Des conditions anormales de transcription conduisent à la formation d'hybrides ARN:ADN (R-loop). Pour les détecter, nous avons construit une lignée cellulaire exprimant une RNAseHI fusionnée à la mCherry et inactive (RmC), mais qui peut se lier aux R-loops. Après micro-irradiation laser, la RmC est recrutée sur l'ADN endommagé. Lorsque l'exclusion de SAF-A est bloquée, le recrutement de la RmC est prolongé. La surexpression de la RNAseHI mutée compromet la survie cellulaire après irradiation aux rayons X. Ces résultats mettent en évidence l'exclusion des protéines de liaison à l'ARN comme la conséquence d'un mécanisme de résolution des R-loops se formant suite aux dommages de l'ADN dans les régions transcrites
Résumé / Abstract : An expanding aspect of the DNA Damage Response (DDR) is its connexion with RNA metabolism. My team has identified the RNA-binding protein SAF-A/hnRNP U as a substrate for DNA-PK, the key kinase in DNA double-strand breaks repair. I have investigated SAF-A involvement in the DDR. After laser microirradiation, SAF-A-GFP dynamics exhibited a two phases profile with a first transient recruitment in the damaged nuclear area followed by a prolonged exclusion. The two phases were uncoupled. SAF-A recruitment was PARP-dependent, while its exclusion relied on ATM, ATR and DNA-PK. SAF-A RNA-binding domain recapitulated SAF-A dynamics after DNA damage. Mass-spectrometry analysis using this domain as a bait identified mostly RNA-binding partners, at least two of them (FUS and TAF15) exhibited similar dynamics. Upon transcription inhibition, SAF-A exclusion was abolished, supporting that it concerns the pool of SAF-A engaged in RNA metabolism. Given that abnormal transcription conditions have been shown to promote RNA:DNA hybrids formation (R-loop), we constructed a cell line expressing a catalytically inactive mCherry-tagged RNAseHI (RmC), which retains its ability to bind R-loop. RmC recruitment to the laser damage site was abolished upon transcription inhibition. When SAF-A exclusion was blocked, RmC exhibited a prolonged recruitment, supporting that SAF-A release is a readout of R-loops resolution post-DNA damage. Finally, overexpressing this mutated RNAseHI negatively impacted cell survival after X-ray irradiation. These results uncover an anti-R-loop mechanism at DNA damage sites in transcribed areas testified by the post-damage exclusion of RNA-binding proteins from these sites