Etude de l'efficacité et des mécanismes de la présentation croisée d'antigènes cellulaires tumoraux intacts par les cellules dendritiques / Camille Baey ; sous la direction de Anne Hosmalin et de Vincent Feuillet

Résumé / Abstract : Les cellules dendritiques (DC) sont spécialisées dans la capture, l’apprêtement et la présentation des antigènes. Elles ont développé une voie spécifique de présentation, la présentation croisée, leur permettant d’internaliser des antigènes exogènes, de les digérer et de les associer aux molécules du CMH de classe I afin de les présenter aux lymphocytes T CD8+. La présentation croisée est essentielle à la présentation d’antigènes qui ne sont pas synthétisés directement dans les DC (antigènes du soi, de tumeurs, de microorganismes n’infectant pas les DC) et donc à l’établissement de réponses T CD8+ anti‐infectieuses ou anti-tumorales. Son étude est donc primordiale pour la vaccination et pour l’immunothérapie mettant en jeu une présentation par les DC. Notre équipe a montré qu’à l’instar des cellules apoptotiques, les cellules vivantes sont une source d’antigènes efficace pour la présentation croisée par les DC in vitro et in vivo. Elle a ainsi montré que l’immunisation de souris avec des DC ayant capturé du matériel provenant de cellules vivantes permettait de protéger efficacement contre une tumeur dérivée de cellules de mélanome (B16) dans un protocole de type prophylactique. Durant ma thèse, j’ai pu montrer que cette immunisation était également très efficace dans un protocole de type thérapeutique. De façon surprenante, la protection et la réponse T CD8+ obtenues en utilisant des cellules vivantes comme source d’antigènes sont meilleures que celles obtenues avec des cellules apoptotiques. Les DC cultivées avec des cellules donneuses d’antigènes, vivantes ou apoptotiques, expriment des niveaux équivalents de molécules de costimulation. En revanche, les DC cultivées avec des cellules apoptotiques sécrètent plus d’IL--‐10, leur conférant un phénotype plus tolérogène. De plus, nous avons également montré que les antigènes tumoraux étaient mieux préservés au sein des cellules vivantes que des cellules apoptotiques, et que la quantité de complexes CMH--‐I/peptide à la surface des DC après culture avec des cellules vivantes était plus importante qu’après culture avec des cellules apoptotiques. Dans une seconde partie de ma thèse, je me suis attachée à caractériser les récepteurs et mécanismes impliqués dans le transfert d’antigènes provenant de cellules vivantes aux DC. J’ai pu montrer que ce transfert ne dépend ni de la sécrétion d’exosomes, ni du « cross-dressing ». En revanche, il est initié après un contact étroit avec les DC qui semble dépendre au moins en partie des récepteurs de type scavenger (SR) et de la calréticuline. Les images obtenues en microscopie suggèrent le passage de molécules de grande taille au sein d’une structure qui pourrait s’apparenter aux jonctions annulaires (Annular Gap Junctions). En effet, nous observons le passage de connexine 43 (Cx3) et de matériel cellulaire sous une conformation native (protéine GFP de 70kDa) provenant de la cellule vivante et colocalisant partiellement avec le marqueur d’endosomes précoces EEA-1 dans la DC. Cependant, l’utilisation de shRNA spécifique de la Cx43 indique que la présentation croisée ne nécessite pas son expression. Nos résultats suggèrent donc l’existence d’un mécanisme de communication intercellulaire permettant le passage d’antigènes de grande taille, qui pourraient ensuite être apprêtés par la DC.

Résumé / Abstract : Dendritic cells (DC) are specialized in the capture, processing and antigen presentation. They have developed a special antigen presentation mechanism, known as cross-presentation, allowing them to internalize exogenous antigens, to digest and associate them to MHC class I molecules for presentation to CD8+ T lymphocytes. The cross-presentation is essential to the presentation of antigens that are not directly synthesized by the DC (self antigens, tumor antigens, microorganisms that don’t infect DC) and therefore to establish anti-infectious or anti-tumoral CD8+ T cell responses. His study is therefore essential for vaccination and immunotherapy involving a presentation by the DC. Our team showed that, like apoptotic cells, living cells are an efficient antigen source for cross-presentation by DC in vitro and in vivo. We have shown that immunization of mice with DCs that have captured material from living cells could protect effectively against a B16 melanoma challenge in a prophylactic model. During my PhD, I have shown that immunization was also very effective in a therapeutic model. Surprisingly, the protection and the CD8+ T cell response obtained using living cells as antigen source, are better than those obtained with apoptotic cells. DCs cultured with live or apoptotic antigen donor cells, expressed equivalent levels of costimulatory molecules. In contrast, DCs cultured with apoptotic cells secrete more IL- 10, giving them a tolerogenic phenotype. Furthermore, we have also shown that tumor antigens were better preserved within living cells than apoptotic cells, and the amount of MHC-I/peptide complexes at the surface of DC after culture with living cells was greater than after culture with apoptotic cells. In a second part of my thesis, I tried to characterize the receptors and mechanisms involved in the transfer of antigen from living cells to DCs. I have shown that this transfer is not dependent on exosomes transfer, nor on "cross-dressing". However, it is initiated after a close contact with the DC that seems to depend at least in part in scavenger receptors (SR) and calreticulin. The microscopy images obtained suggest the passage of large molecules in a structure, which may be similar to annular junctions (Annular Gap Junctions). Indeed, we observe the passage of connexin 43 (Cx3) and cellular material in a native conformation (GFP 70 kDa protein) from the living cell that partially colocalize with the early endosome marker EEA-1 in DCs. However, the use of an shRNA specific for Cx43 indicates that the cross-presentation does not require its expression. Our results suggest the existence of a mechanism of intercellular communication allowing the passage of large antigen, which could then be processed by DCs.