Conception et synthèse de nouveaux outils chimiques pour l'étude des phosphoprotéines et la caractérisation de la liaison d'un ligand à son récepteur par spectrométrie de masse MALDI-TOF / Guillaume Miralles ; sous la direction de Gilles Subra

Date :

Type : Livre / Book

Type : Thèse / Thesis

Langue / Language : français / French

Spectrométrie de masse

Spectrométrie de masse MALDI

Spectrométrie de masse avec ionisation électrospray

Phosphoprotéines

Tryptophane

Spectrométrie de masse à ionisation chimique

Subra, Gilles (1971-....) (Directeur de thèse / thesis advisor)

Martinez, Jean (1949-.... ; biochimiste) (Président du jury de soutenance / praeses)

Melnyk, Oleg (1966-....) (Rapporteur de la thèse / thesis reporter)

Fournier, Isabelle (19..-.... ; biologiste) (Rapporteur de la thèse / thesis reporter)

Campagne, Jean-Marc (1967-.... ; chimiste) (Membre du jury / opponent)

Mouillac, Bernard (1963-....) (Membre du jury / opponent)

Université des sciences et techniques de Montpellier 2 (1970-2014) (Organisme de soutenance / degree-grantor)

École doctorale Sciences Chimiques Balard (Montpellier ; 2003-2014) (Ecole doctorale associée à la thèse / doctoral school)

Résumé / Abstract : Depuis l'avènement des techniques d'ionisation douces comme le MALDI ou l'ESI, la spectrométrie de masse est devenue un outil incontournable pour l'étude des biomolécules, et en particulier, des protéines. Le mécanisme d'ionisation spécifique des sources MALDI introduit un phénomène de discrimination spectrale généralement considéré comme un frein. Le greffage d'un motif α-cyano 4-hydroxy cinnamique ou HCCA sur un peptide permet d'en tirer parti en créant une discrimination spectrale favorable au composé marqué. Deux applications du marquage HCCA ont été développées au cours de ce travail de thèse.Une des limitations des études phosphoprotéomiques réside dans la faible ionisation des peptides phosphorylés. De nombreuses méthodes de purification ont été proposées pour contourner ce problème. Nous avons étudié une approche alternative qui consiste à greffer spécifiquement un motif HCCA sur une position phosphorylée afin d'amplifier les signaux des peptides d'intérêt. Nous avons développé en parallèle une méthodologie pour l'étude de la liaison d'un ligand peptidique à son récepteur ne nécessitant pas de radioactivité. Le greffage covalent d'HCCA sur un ligand nous a permis de le détecter et de le quantifier dans une expérience de déplacement. Cette méthodologie a notamment permis de déterminer l'affinité d'un ligand de référence pour le récepteur V1A à la vasopressine.

Résumé / Abstract : Since the advent of soft ionization techniques such as MALDI or ESI, mass spectrometry has become an indispensable tool for the study of biomolecules, and particularly proteins. The specific ionization mechanism of MALDI leads to a spectral discrimination phenomenon generally regarded as a restriction. The α-cyano 4-hydroxy cinnamic acid (HCCA) pattern grafting on a peptide can take advantage by introducing a spectral discrimination in favor of the labeled compound. Two applications have been developed during this thesis, based on HCCA tagging.A limitation of phosphoproteomic studies is the low ionization of phosphorylated peptides. Many purification methods have been reported to circumvent this problem. We studied an alternative approach which consists in specifically grafting a HCCA moiety on a phosphorylated position in order to amplify the signal of interest peptide.At the same time, we have developed a methodology for the study of ligand peptidic binding to its receptor which does not require radioactivity. The covalent HCCA tagged ligand has allowed us to detect and quantify it, in a binding displacement assay. More particularly, this methodology allowed us to determine the affinity of a reference ligand for the V1A vasopressin receptor.