Date : 2012
Type : Livre / Book
Type : Thèse / ThesisLangue / Language : français / French
Leishmaniose cutanée -- Génétique
Inhibiteurs de protéases -- Dissertation universitaire
Protéines sécrétoires inhibitrices de protéinases -- Dissertation universitaire
Classification Dewey : 616
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Résumé / Abstract : HslVU est une protéase dépendante de l'ATP découverte initialement chez certaines bactéries, et considérée comme une forme ancestrale du protéasome. Elle est constituée par l'association de deux sous-complexes : la protéase HslV, formée elle-même de deux anneaux hexamériques de la sous-unité HslV, et l'ATPase HslU, un hexamère de la sous-unité HslU, qui active l'activité peptidasique de HslV en s'associant à l'une ou à ses deux extrémités. HslVU a été identifiée dans la mitochondrie de protozoaires parasites, dont ceux de la famille des trypanosomatidae comme Leishmania major (agent de la leishmaniose) et Trypanosoma brucei (agent de la maladie du sommeil). Différents travaux ont montré que, chez T. brucei, l'inactivation d'HslVU par interférence ARN conduit à l'arrêt de la division cellulaire et à la mort du parasite. Puisqu'elle est absente chez l'homme, HslVU constitue donc une cible thérapeutique potentielle intéressante pour lutter contre ces parasites. Dans le cadre d'un projet collaboratif, le but de ma thèse était de caractériser la protéase HslVU de Leishmania major (LmHslVU), et de tester l'intérêt d'exploiter la symétrie de HslV pour développer des inhibiteurs empêchant la formation du complexe HslVU en se fixant à l'interface HslV/HslU. Dans ce contexte, ma thèse s'est développée autour de 3 axes principaux : (i) Production et caractérisation biochimique de LmHslV recombinant. J'ai montré que le complexe LmHslV seul est inactif, contrairement à son homologue bactérien qui a une activité basale même sans HslU, et qu'il peut être activé par des peptides synthétiques correspondant à l'extrémité C-terminale de son régulateur HslU, comme HslV d'E.coli et d'H.influenzae. Cela m'a permis de développer un test de l'activité peptidasique de LmHslV in vitro, miniaturisable pour un futur criblage de banques de molécules chimiques. La protéase LmHslV a également été caractérisée en testant l'effet de différents inhibiteurs de protéases sur son activité. Ce travail m'a également permis de montrer que l'activité peptidasique de HslV est très sensible à la présence d'ions Mg2+ dans les tampons d'activité, ce qui suggère qu'il existe des régulations allostériques des sites actifs de la protéase. (ii) Exploiter la symétrie de HslV pour développer des interacteurs multivalents de HslV. Nous avons cherché à vérifier expérimentalement si le fait d'utiliser des molécules multivalentes, c'est à dire possédant plusieurs sites d'interaction à HslV, permettait d'augmenter sensiblement l'affinité de ces molécules. Une molécule pentamérique, le « peptabody », capable de se fixer sur LmHslV via cinq sites d'interaction potentiels et agissant comme un inhibiteur de l'activité peptidasique de HslV, a été développée.(iii) Caractérisation du mode d'activation de LmHslV. Nous avons réalisé en collaboration des expériences de microscopie électronique sur LmHslV, qui ont révélé une possible rotation des deux anneaux de LmHslV liée à l'activation de la protéase. Cette rotation est spécifique de LmHslV puisqu'on ne l'observe pas chez HslV d'E. coli. La confirmation de ces résultats encore préliminaires est en cours.
Résumé / Abstract : HslVU is an ATP-dependent protease initially discovered in certain bacteria, and considered as a proteasome ancestor. It is formed by assembly of two subcomplexes: the HslV protease, itself resulting from the assembly of two hexameric rings of the HslV subunit, and the HslU ATPase, an hexamer of the HslU subunit that activates HslV upon binding.HslVU has been identified within the mitochondrion of protozoan parasites, including the Trypanosomatids Leishmania major (leishmaniasis) and Trypanosoma brucei (sleeping sickness). Different results have shown that inactivation by siRNA of HslVU leads in T. brucei to growth arrest and cell death. Since HslVU is absent in human, it thus represents an attractive drug target for the fight against these parasites. In the frame of a collaborative project, the objective of my thesis was to characterize the HslVU protease of Leishmania major (LmHslVU) and to assess the interest of exploiting HslV symmetry to develop inhibitory molecules that would block the formation of the HslVU complex by binding at the HslV/HslU interface.In this context, I studied three main issues during my PhD thesis:(i) Production and biochemical characterization of recombinant LmHslV: I could show that the HslV complex alone is inactive, contrary to its bacterial homolog which has a basal activity even in the absence of HslU, and that, as E. coli HslV, it can be activated by synthetic peptides corresponding to the C-terminal end of HslU. This work allowed me to develop an in vitro assay of HslV peptidase activity, that can be miniaturized for future screenings of chemical libraries. The active site of the LmHslV protease has also been characterized by testing the effect of different protease inhibitors on the peptidase activity. During this work, I could show that LmHslV activity is sensitive to Mg2+ ions in the activity buffers, suggesting the existence of allosteric regulations of the active sites.(ii) To exploit HslV symmetry to develop multivalent interactors of HslV. Our goal was to experimentally verify whether the use of multivalent molecules, i.e. molecules with several interaction sites to HslV, could help to develop high affinity inhibitors. A pentameric molecule, called the “peptabody”, able to bind to HslV via five interaction sites and acting as a strong inhibitor of HslV, has been developed.(iii) Characterization of the mode of activation of HslV. We performed through a collaboration electronic miscroscopy analyses of LmHslV, which revealed that the activation of the protease could be linked to a possible rotation of its two rings. Such rotation was not seen with E. coli HslV, suggesting that it is a mechanism specific of LmHslV. Study are ongoing to confirm these results.