Date : 2012
Editeur / Publisher : [S.l.] : [s.n.] , 2012
Type : Livre / Book
Type : Thèse / ThesisLangue / Language : français / French
Glandes endocrines -- Dissertation universitaire
Récepteurs à la gonadolibérine -- Dissertation universitaire
Syndrome de Down -- Dissertation universitaire
Protein kinases -- Dissertation universitaire
Modèles animaux de maladie humaine -- Dissertation universitaire
Résumé / Abstract : Le Syndrome de Down, aneuploïdie la plus courante, a pour cause première la présence d'un chromosome 21 Numéraire. L'établissement de cartes de corrélation génotypes/phénotypes chez les patients atteints du Syndrome de Down a permis de mettre en évidence la kinase DYRKIA, codée par le gène DYRKIA localisé dans la région DCR-1 du chromosome 21, comme candidat pouvant être impliqué dans l'apparition d'un retard mental. Comprendre le rôle et la régulation de DYRKIA est donc essentiel et pour cela, utiliser un test fiable de mesure d'activité de l'enzyme est indispensable. Nous avons développé une nouvelle méthode de dosage de l'activité kinase de DYRKIA utilisant la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC). Cette méthode s'est révélée très sensible et peu coûteuse. En utilisant cette nouvelle méthode, nous avons confirmé les principales données obtenues in vitro sur l'activité de DYRKIA. Nous avons également caractérisé le comportement d'inhibiteurs connus de DYRKIA (harmine) et confirmé les résultats rapportés dans la littérature. En collaboration avec l'équipe du Dr. Dodd nous avons criblé des dérivés hétérocycliques azotés de faible poids moléculaire, inhibiteurs potentiels de DYRKIA. Enfin, le test d'activité a été utilisé ex vivo sur des extraits de cerveau de souris. Nos résultats indiquent que cette nouvelle méthode de dosage d'activité kinase est spécifique, reproductible et rapide. Elle peut potentiellement s'appliquer à d'autres kinases, phosphatases et plus largement à d'autres enzymes catalysant une réaction de modification de protéines.
Résumé / Abstract : La GnRH joue un rôle essentiel en régulant la sécrétion et la synthèse de LH et de FSH via des récepteurs spécifiques (GnRHR) exprimés à la surface des cellules gonadotropes hypophysaires. L'expression tissulaire spécifique du Gnrhr est contrôlée par une combinatoire bien définie de facteurs de transcription comportant trois acteurs majeurs, SF1, LHX3 et ISL1. Au contraire du Gnrhr, nous montrons que les séquences régulatrices d'M7 en amont du site d'initiation de transcription (TSS) sont insuffisantes pour diriger l'expression hypophysaire spécifique, suggérant l'existence de mécanismes additionnels. De fait, les régions régulatrices (ou promoteurs) ainsi que les "corps" des gènes sont altérés par des modifications épigénétiques. Les résultats, obtenus par immunoprécipitation de la chromatine, montrent que dans les lignées cellulaires exprimant Isl1, notamment les cellules gonadotropes, Isl1 est complexé avec des histones H3 triméthylées sur la Lys4 (H3K4Me3) au niveau du TSS, une marque d'histones corrélée avec les gènes actifs. En revanche, dans les lignées cellulaires où Isll est silencieux, il est complexé avec des histones H3 triméthylées sur la Lys27, marque liée à la répression des gènes. On observe cette même corrélation au niveau du TSS du Gnrhr. De plus, notre étude suggère que la méthylation de F ADN, en amont de l'îlot CpG est inversement corrélée à l'activité de ce gène. Ces données suggèrent que les modifications épigénétiques sont essentiellement responsables de l'expression hypophysaire spécifique d'/s/ycontrairement à l'expression du Gnrhr qui semble principalement dépendante de la présence de facteurs de transcription tissulaires spécifiques majeurs.
Résumé / Abstract : Down syndrome is the most common aneuploidy, it originates from the presence of an extra 21st chromosome. The establishment of genotype/phenotype correlations in patients with Down's syndrome made it possible to highlight the DYRKIA kinase, encoded by the DYRKIA gene localized in the region DCR-1 on 21st chromosome, as a good candidate in the onset of mental retardation. Understandïng the role and regulation of DYRKIA is thus necessary and for that, to get a reliable kinase activity assay is essential. First, we focused on the establishment of a new method of DYRKIA kinase activity assay using High Pressure Liquid Chromatography (HPLC). This method proved to be highly sensitive and affordable. Second, we sought to confirm previous data on in vitro activity of DYRKIA by using this new method. We also characterized the behavior of known inhibitors of DYRKIA (harmine) and the results obtained are in agreement with the literature. In collaboration with Dr. Dodd's team, we screened various molecules as potential inhibitors of DYRKIA. Finally, the activity assay was tested ex vivo, in mice brain extracts. Our results indicate that this new method of kinase activity assay is specific, reproducible and fast. This method can be potentially applied to other kinases, phosphatases and more broadly to other enzyme catalyzing a reaction of protein modification.
Résumé / Abstract : GnRH plays a critical role by regulating LH and FSH secretion and synthesis via specific receptors (GnRHR) expressed at the surface of gonadotrope cells. Tissue-specific expression of Gnrhr is arbitrated by a combinatorial code of transcription factors that involves SF1, LHX3 and ISLL Unlike for Gnrhr, we showed that Ml regulatory sequences upstream of the transcription start site (TSS) were not sufficient to direct pituitary-specific expression, suggesting the existence of additional regulatory mechanisms. Indeed regulatory regions (or promoters) as well as gene bodies, are altered by epigenetic modifications. Results of chromatin immunoprecipitation reveal that in cell lines expressing Isll, namely gonadotrope cells, Isll was linked to histone H3 tri-methylated on Lys4 (H3K4Me3) at thé TSS, an histone mark correlated with gène activity. In contrast, in cell Unes where Isll was silent, Isll was bound by histone H3 tri-methylated on Lys27, a histone mark linked to gene repression. Similar correlation between histone modifications and gene activities where observed at the Gnrhr TSS. Our study further suggests that DNA methylation upstream of the CpG Island of Isll was inversely correlated with gene activity. Together, these data suggest that epigenetic modifications predominantly direct Isll tissue-specific expression whereas Gnrhr expression is primarily dependent on the presence of master tissue-specific transcription factors.