Date : 2012
Type : Livre / Book
Type : Thèse / ThesisLangue / Language : français / French
Résumé / Abstract : Le xeroderma pigmentosum (XP) est une maladie génétique rare caractérisée par une hypersensibilité aux ultraviolets (UV) et une forte incidence des tumeurs cutanées. Les cellules des patients XP sont incapables d’éliminer les lésions induites dans l’ADN par les UV en raison d’un dysfonctionnement du mécanisme de réparation par excision de nucléotides (NER). Plusieurs groupes de complémentation ont été identifiés dans le syndrome XP, parmi lesquels le groupe XP-C représente la majorité des patients à travers le monde.Au cours de mon travail de thèse, j’ai développé un modèle de correction ciblée par recombinaison homologue (RH) d’une délétion de deux nucléotides au niveau de l’exon 9 du gène XPC aboutissant à l’apparition prématurée d’un codon stop. Afin de stimuler la RH, deux types de nucléases ingéniérées sont utilisées : les méganucléases et les TALENs. J’ai observé que la méthylation de la séquence ciblée pouvait affecter l’activité de celles-ci et donc l’efficacité du ciblage de gène. Cependant, deux approches ont été développées pour résoudre ce problème : l’utilisation d’un agent déméthylant (5-aza-2’-désoxycytidine (5azadC)) ou la création d’une endonucléase insensible à la méthylation. L’utilisation des méganucléases en combinaison avec la 5azadC a permis de stimuler la fréquence de coupure de presque 20 fois dans des fibroblastes XPC et la TALEN modifiée permet une augmentation de 40 fois. Avec ces deux stratégies j’ai obtenu des événements de correction génétique par introduction d’une matrice de réparation dans le locus ciblé avec une fréquence proche de 3%. La caractérisation des clones corrigés avec la TALEN XPC montre la correction génomique des deux nucléotides dans l’exon 9, une restauration de l’expression de la protéine XPC et une résistance cellulaire après irradiation UV traduisant le rétablissement des fonctions de la NER. Cette étude représente la première preuve de correction génétique de cellules déficientes en protéine XPC en utilisant une approche ciblée.
Résumé / Abstract : Xeroderma pigmentosum (XP) is a rare inherited genetic disorder characterized by an UV hypersensitivity and a severe predisposition to skin cancers. Cells from XP patients are deficient in nucleotide excision repair (NER) of UV‐induced DNA lesions. Several complementation groups have been identified in the XP syndrome and the XP-C group represents the majority of XP patients around the world. During my PhD work, I developed a model of targeted correction by homologous recombination (HR) in order to correct a deletion of two nucleotides in the ninth exon in XPC gene leading to a premature stop codon. To stimulate HR, I used two types of engineered endonucleases : meganucleases and TALEN. I observed that the target methylation status could affect the endonuclease activities and therefore XPC gene correction. Nervertheless, I developed two approaches to overcome this methylation sensitivity : use of a demethylating agent (5-aza-2-deoxycytidine (5azadC)) or a specific engineering of TALEN. Using 5azadC with meganuclease allowed to stimulate the cutting frequency by nearly 20 fold in XPC fibroblasts and the engineered TALEN allowed a 40 fold-increase in frequency. With both strategies I obtained genetic correction events by repair matrix introduction in the targeted locus with a near 3% frequency. The characterization of corrected clones with the XPC TALEN shows genomic correction in the ninth exon, a restoration of the XPC protein expression and cell survival following UV exposure, thus demonstrating fully recovered normal repair activity by NER. This study represents the first evidence of genetic correction of XPC-deficient cells by a targeted approach.