Date : 2011
Editeur / Publisher : [S.l.] : [s.n.] , 2011
Type : Livre / Book
Type : Thèse / ThesisLangue / Language : français / French
Protéines de la matrice virale -- Dissertation universitaire
Dynamines -- Dissertation universitaire
Vesiculovirus -- Dissertation universitaire
Techniques de double hybride -- Dissertation universitaire
Mutation -- Dissertation universitaire
Résumé / Abstract : La protéine de matrice (M) du virus de la stomatite vésiculaire (VSV) est une petite protéine multifonctionnelle de 26,6 kDa. La protéine M joue un rôle majeur dans les processus d'assemblage et de bourgeonnement du VSV. Elle est aussi responsable de l'extinction des synthèses cellulaires, elle déstabilise le réseau de microtubule et induit l'apoptose par voie mitochondriale. Pour remplir l'ensemble de ses fonctions, la protéine M recrute des partenaires cellulaires. Certains de ces partenaires étaient déjà connus. Parmi ceux-ci, nous nous sommes intéressés aux protéines Nedd4, une ubiquitine ligase, et TSG101, un composant du complexe ESCRT I. Lors d'un crible double hybride effectué au laboratoire, nous avons identifié trois nouveaux partenaires de la protéine M : la dynamine, une GTPase impliquée dans le processus d'endocytose, LMP2, une sous-unité catalytique de l'immunoprotéasome et l'a-caténine, une protéine appartenant aux complexes formant les jonctions intercellulaires. Dans un premier temps, nous avons étudié les rôles des protéines Nedd4, TSG101 et dynamine dans les étapes tardives du cycle viral : l'assemblage et le bourgeonnement. Nous avons caractérisé des virus recombinants mutants dont la protéine de matrice n'interagit plus avec un ou deux de ces partenaires. Pour ce faire, nous avons mis au point une nouvelle technique, plus précise, de titration du virus par fluorescence. Cette technique a été utilisée pour établir les cinétiques de production des différents virus recombinants dans divers types cellulaires. L'ensemble de nos résultats suggère que TSG101 a un rôle dans le bourgeonnement que l'on ne met en évidence que dans un contexte de double mutation. Nos observations de microscopie électronique nous ont indiqué que la dynamine intervient en amont de la protéine Nedd4. Enfin, les virions dont la protéine de matrice n'interagit plus avec Nedd4 ont une morphologie aberrante et leur protéine de matrice n'est plus ubiquitinylée. Nous nous sommes ensuite intéressés aux nouveaux partenaires de la protéine de matrice : les protéines LMP2 et l'a-caténine. Nous avions exprimé ces protéines en fusion avec la GST et nous avons montré que ces constructions étaient bien capables d'interagir avec la protéine de matrice, confirmant ainsi les interactions mise en évidence par double hybride. Enfin, nous avons précisé les résidus et les domaines impliqués dans les associations M-LMP2 et M-a-caténine. Des expériences préliminaires nous ont aussi permis de voir que la protéine de matrice et l'a-caténine colocalisent au niveau de la membrane des cellules. L'ensemble de ces résultats contribue à une meilleure compréhension de l'interactome complexe de la protéine de matrice et au rôle des diverses protéines le constituant.
Résumé / Abstract : The matrix protein (M) of vesicular stomatitis virus (VSV) is a multifunctional 26,6 kDa small protein. M protein plays a key role in assembly and budding processes and is responsible for cellular synthesis shut down, microtubules destabilization and apoptosis. For these reasons, M protein recruits several cellular partners. Among cellular proteins identified so far, we are interested in Nedd4, E3 unbiquitin ligase and TSG101, a component of ESCRT I complex. 2-Yeast Hybrid technique allowed us to identify three news partners for M protein: Dynamin, protein involved in endocytic pathway, LMP2, catalytic subunit of immunoproteasome and Catenin a, that belongs to intercellular junctions. First, we studied the implication of Nedd4, TSG101 and dynamin during late stages of the viral cycle: assembly and budding. We characterized recombinants mutant virus containing matrix protein that does not interact anymore with one or two partners. For that, we developed a new technique to titrate with higher accuracy viral supernatants. We applied this technique for growth curves in different cell type. Our results" suggest that TSG101 plays a role during budding that highlighted with double mutant virus. EM observations indicate that dynamin acts upstream Nedd4. We also showed that some viral particles produced from an infection using virus containing M protein that does not interact with Nedd4 display an aberrant morphology and their M protein is no longer ubiquitinated. After, we started the study of new partners of M protein: LMP2 and Catenin a, previously identified. We expressed these proteins in fusion with GST and we have shown that these buildings were well able to interact with the M, confirming both interactions. Finally we could define residues and domains involved in M-LMP2 and M-Catenin a interactions. Preliminary experiments show that M protein and Catenin a colocalize at level of epithelial cells membrane.An results contribute to a better understanding of the interactome complex matrix protein.