Date : 2009
Editeur / Publisher : [S. l.] : [s.n.] , 2009
Type : Livre / Book
Type : Thèse / ThesisLangue / Language : français / French
Facteurs de virulence -- Dissertation universitaire
Résumé / Abstract : Brucella, utilise un système de sécrétion de type IV (T4SS) afin de survivre et de se multiplier dans les cellules hôtes. Ce travail décrit l’importance de Galectine-1 (Gal1) dans l’infection par Brucella, et de son interaction avec le composant minoritaire du pilus du T4SS, VirB5. Durant notre étude, nous avons rencontré des difficultés lors de la complémentation d’un mutant virB5. Des multiples copies du promoteur virB et la surexpression de virB5 perturbent l’expression de VirB9 et VirB10, atténuant la virulence de Brucella. Nos résultats montrent l’importance du choix du plasmide afin de complémenter des composants individuels du T4SS. En utilisant un plasmide « low copy », nous avons trouvé que les 5 acides aminés de l’extrémité C-terminale de VirB5 sont absolument requis pour la virulence. En revanche, la délétion des 3 résidus de l’extrémité C-terminale de virB5, important pour l’interaction avec Gal1 in vitro, n’entraîne qu’une perte partielle de la virulence lors de la phase précoce de l’infection. De manière intéressante, l’infection de macrophages gal1-/- a montré que Gal1 est aussi important pour le stade précoce de l’infection par Brucella, et aucun effet supplémentaire n’est détecté lors d’infections par virB5D3C. Nos résultats suggèrent que les 3 acides aminés C-terminaux de virB5 sont importants pour l’interaction avec Gal1.durant l’infection, et qu’une délétion plus importante de la partie C-terminale de virB5 conduirait à des effets secondaires, comme la perturbation de l’assemblement du T4SS. Cette étude montre le premier rôle de Gal1 dans la virulence bactérienne et la première fonction intracellulaire de Gal1 dans la relation hôte/pathogène
Résumé / Abstract : Le pathogène intracellulaire facultatif, Brucella, utilise un système de sécrétion de type IV (T4SS) afin de survivre et de se multiplier dans les cellules. Ce T4SS joue un rôle majeur dans la création de la niche de réplication de Brucella en perturbant le trafic vésiculaire de la cellule infectée. Ce travail décrit l’importance du composant minoritaire du pilus du T4SS, VirB5, dans la virulence de Brucella et de son interaction avec Galectine-1 (Gal1) pendant la phase précoce de l’infection par ce pathogène. Durant notre étude, nous avons rencontré des difficultés lors de la complémentation génétique du mutant virB5. En utilisant des plasmides aux nombres de copies différents, nous avons trouvé que la présence de multiples copies du promoteur virB et la surexpression de virB5 perturbent l’expression de VirB9 et VirB10, entraînant une atténuation de la virulence de Brucella. Nos résultats confirment l’importance de l’expression stoechiométrique des composants du T4SS ainsi que l’importance du choix du plasmide et du promoteur afin de complémenter des composants individuels de complexes multi-protéiques comme les systèmes de sécrétion. En utilisant ces conditions de complémentation optimisées, nous avons étudié le rôle de l’interaction entre Gal1 et VirB5 lors d’infection par Brucella. Nous avons trouvé que les 5 acides aminés de l’extrémité C-terminale de VirB5 sont requis pour la virulence dans les macrophages. En revanche, la délétion des 3 acides aminés de l’extrémité C-terminale n’entraîne qu’une perte partielle de la virulence, indiquant que ces résidus ne sont pas requis pour l’assemblement du T4SS et/ou la localisation de VirB5. Des études in vitro ont permis de montrer que les 3 acides aminés de l’extrémité C-terminale étaient importants pour l’interaction avec Gal1. Utilisant des macrophages primaires gal1-/-, nous avons montré que Gal1 était important pour le stade précoce de l’infection par Brucella. Un phénotype similaire a été observé lors de l’infection de cellules sauvages par le mutant virB5 exprimant VirB53C. De manière intéressante, aucun effet supplémentaire n’a été détecté lors d’infections de cellules gal1-/- par virB5(virB53C), suggérant que l’atténuation, observée chez ce mutant, est due à son incapacité à interagir avec Gal1. Pour résumer, nos données suggèrent fortement un rôle de l’interaction entre Gal1 et VirB5 pendant l’infection précoce par Brucella. Cette étude montre pour la première fois, un rôle intracellulaire de Gal1 dans la relation hôte/pathogène, et la première implication de Gal1 dans la virulence bactérienne.
Résumé / Abstract : The facultative intracellular pathogen Brucella uses a type IV secretion system (T4SS) to survive and replicate in professional and non-professional phagocytes. This T4SS plays a major role in the perturbation of vesicular trafficking in order to create the Brucella replication niche. This work describes the importance of the minor component of the pilus, VirB5, in Brucella infection, and its interaction with Galectin-1 (Gal1) during the early phases of the bacterium’s intracellular life stages. During our study, we encountered problems in genetic complementation of a virB5 mutant. Using plasmids with different copy numbers, we found that the presence of multiple virB promoter sequences and the strong overexpression of virB5 from a high number copy vector disturbed levels of VirB9 and VirB10, leading to attenuation in virulence. Our results emphasized the importance of production of T4SS components with correct stochiometry, as well as plasmid and promoter choice for complementation studies of individual components of specialized protein complexes, such as secretion systems. Using optimized complementation conditions, we analyzed the role of the interaction between Gal1 and VirB5 in Brucella infection. We found that the 5 C-terminal amino acids of VirB5 are absolutely required for virulence in macrophages. In contrast, removal of the 3 C-terminal amino acids of VirB5 resulted in only partial loss of virulence, indicating that the 3 C-terminal amino acids of VirB5 are dispensable for correct T4SS assembly and/or VirB5 localization. In vitro assays we showed that these 3 C terminal amino acids were important for interaction with the human protein Gal1. Using gal1-/- primary macrophages we showed that Gal1 was important during the early stages of Brucella infection. A similarly attenuated phenotype was observed when wild type cells were infected with the virB5Δ3C mutant. Interestingly, no cumulative effect was seen when gal1-/- macrophages were infected with virB5Δ3C, suggesting that the attenuation of this mutant is due to the inability to interact with Gal1. Summarizing, our data are highly suggestive of a role for the interaction between VirB5 and the Gal1 during the early phases of bacterial replication. This study shows the first evidence of an intracellular role for the host protein Gal1 during pathogen infection, and the involvement of Gal1 in enhancing bacterial virulence.