Date : 2008
Editeur / Publisher : [S.l.] : [s.n.] , 2008
Type : Livre / Book
Type : Thèse / ThesisLangue / Language : français / French
Virus -- Reproduction (biologie)
Résumé / Abstract : La formation du complexe de réplication du virus de l’hépatite C est une étape-clé dans le cycle viral. Nous avons précédemment montré que les 220 derniers nucléotides de l’extrémité 3’ du brin (-) se replient en cinq tiges-boucles stables formant le domaine I (Schuster et al. 2002, J. Virol, 76:8058-68). La comparaison des sites d’initiation de la réplication des brins moins (-) et plus (+) a révélé des caractéristiques communes notamment une forte homologie entre la tige-boucle SLEI du brin (–) et la tige-boucle SLII du brin (+). Dans le but d’investiguer la fonction de la tige-boucle SLEI dans le cycle viral et les interactions hôte-virus, nous avons criblé des protéines cellulaires interagissant avec SLEI par la méthode du triple-hybride dans la levure, SLEI servant d’appât et une banque d’ADNc de foie humain de proie. Un mutant de la séquence homologue a servi de contrôle négatif pour confirmer la spécificité de l’interaction. Ce criblage a identifié une forme tronquée de l’Apolipoprotéine E (ApoE) comme une protéine hépatocytaire interagissant avec la tige-boucle SLEI du brin (-) Pour évaluer la pertinence fonctionnelle de cette interaction, nous avons bloqué l’expression de l’ApoE par de petits ARN interférents spécifiques (siARN) dans des cellules Huh7.5 transfectées avec l’ARN génomique complet de la souche Jc1 du VHC. L’extinction de l’expression de l'ApoE a entrainé une forte inhibition de la production de particules infectieuses sans affecter le niveau de réplication du virus. Ces résultats indiquent que SLEI pourrait recruter ApoE au niveau du complexe de réplication et que ce recrutement est important pour l’accomplissement du cycle viral aboutissant à la production de particules infectieuses. Pour mieux comprendre le mécanisme d’intervention de l'ApoE, nous avons recherché une interaction entre les protéines virales et ApoE par la méthode du double-hybride dans la levure. Seule, la protéine non structurale NS5A du VHC interagit avec ApoE dans ce système d’étude. Cette interaction a été confirmée par des analyses d’immunoprécipitation dans des cellules Huh7.5 répliquant Jc1. Pour discriminer si ApoE intervient spécifiquement dans la sécrétion des virions ou plus précocement dans leur assemblage, nous avons évalué l’infectivité de particules virales récoltées à partir de surnageants de culture ou des lysats de cellules Huh7.5 répliquant Jc1 dans lesquelles l’expression de l’ApoE a été bloquée par des siARN spécifiques. Les particules virales récoltées ont été purifiées et concentrées au moyen de gradients d’iodixanol puis utilisées pour infecter des cellules Huh7.5 naïves. Les particules virales provenant des lysats cellulaires sont plus infectieuses que celles issues de surnageants de culture cellulaire. Nos résultats démontrent une forte implication de l’ApoE dans la sécrétion des virions du VHC et en font une cible intéressante pour la thérapie antivirale.
Résumé / Abstract : Formation of the hepatitis C virus (HCV) replication complex represents a key step in the viral life cycle. We have previously demonstrated that the last 220 nucleotides of the HCV 3’ minus strand fold into five stable stem-loops forming domain I (Schuster et al. 2002, J. Virol, 76:8058-68). Comparison of the replication initiation sites on minus (-) and plus (+) strands revealed common structural features including a marked sequence homology between stem loop EI (SL-EI) of (-) strand and the (+) strand stem loop II. Aiming to investigate the function of SL-EI for the viral life cycle and virus-host interactions, we screened cellular proteins interacting with SL-EI using a yeast three-hybrid assay with SL-EI as bait and a human liver cDNA library as prey. A reverse mutant of the homologous sequence was used as a negative control to confirm specificity of the interaction. The yeast three-hybrid screen identified a truncated part of apolipoprotein E (ApoE) as a hepatocyte protein interacting specifically with SL-EI of HCV (-) strand. To investigate the functional relevance of this interaction, we silenced ApoE expression by siRNAs in Huh7.5 cells transfected with HCV Jc1 full-length RNA. Silencing of ApoE expression resulted in a marked inhibition of infectious particle production without affecting the level of viral replication. These results indicate that SL-EI may recruit ApoE to the viral replication complex and that this recruitment may play a role for completion of the viral life cycle resulting in production of infectious particles. In order to gain more insights in the mechanism, we checked an interaction between the viral proteins and ApoE by yeast two hybrid assay. Only the HCV non structural protein NS5A was found to interact with ApoE in this system. This interaction was confirmed in Huh7.5 cells replicating Jc1 by co-immunoprecipitation. To discriminate between an effect of ApoE on secretion of infectious virions or more early on their assembly, we evaluated the infectivity of intra- or extra-cellular viral particles produced in HCV Jc1 replicating Huh7.5 cells in which ApoE was silenced. Virions were purified on iodixanol gradients and then used to infect naive Huh7.5 cells. We found that particles obtained from cells lysates were more infectious than those obtained from cell supernatants. These results show a specific impact of ApoE on virions secretion. Taken together, our results support a strong involvement of ApoE in the HCV secretion pathway and identify this protein as an interesting target of HCV antiviral therapy.