Date : 2009
Editeur / Publisher : [S.l.] : [s.n.] , 2009
Type : Livre / Book
Type : Thèse / ThesisLangue / Language : français / French
Résumé / Abstract : Ascidians (urochodates: Ciona intestinalis and Phallusia mammillata ) are considered the closest invertebrate ancestors of vertebrates. They develop into simple tadpoles made of 2600 cells harboring a notochord and a dorsal nerve chord. At the turn of the 20th century, the ascidians model contributed much to the idea that oocytes contained localized determinants of development. This led to the concept of mosaic development. Today we know that some of these determinants are maternal RNAs localized in the egg cortex. Ascidian determinant RNAs are part of a large family of maternal RNAs called postplasmic/PEM RNAs. They include about 40 transcrips classified as Type I (localized before fertilization) and Type II (localized after fertilization). Type I postplasmic/PEM RNAs are relocalized after fertilization in a stereotyped fashion such that they concentrate in the posterior region of the zygote and form a compact cortical zone in the 2 posterior vegetal blastomeres at the 8 cell stage called the CAB (Centrosome Attracting Body). The large numbers of postplasmic/PEM RNAs identified, the synchronicity and abundance of embryos, and the ability to isolate cortical fragments retaining the RNAs make the ascidian model particularly attractive for studying localization and cortical anchorage of polarized RNAs. It is possible to operate a first classification of postplasmic/PEM RNAs based on their localization in cells in the tail of the tadpole. The determinant Macho1 and PEM1 segregate in 2 B8.11 cells with somatic destinies while RNAs such as the germ plasm marker Vasa is in addition localized in 2 B.12 cells precursors of the germ line. The 3’ UTR regions of postplasmic/PEM RNA are considered to contain part of the code for localization and anchorage. In Ascidians as in the amphibian Xenopus these regions are characterized by frequent xCACx repeats. Using this criteria to screen 3’UTRs of all Ciona intestinalis genes, we confirmed that frequent xCACx repeats constituted a predictive signature for postplasmic/PEM RNAs and found 2 new members (MnK et PSD). We have also identified subcellular anchorage sites of postplasmic/PEM RNAs using high resolution immuno-in situ localization techniques in oocytes and embryos as well as in cortical fragments isolated from them. The RNA determinants Macho1 and PEM1 are associated with a sub-domain of cortical Endoplasmic Reticulum (cER) while Vasa, PEM3, POPK RNAs are localized in granules (putative germ granules). This demonstrates that although at low resolution these RNAs appear co-localized in the cortex they have in fact different structures of anchorage. This allows to propose that postplasmic/PEM RNAs belong to 2 categories: a category (“Vasa-Type” ) associated with granules and segregating in both 8.11 and 8.12 cells and a category (“Macho1-Type”) associated to cER which segregates only into B8.11 cells. We also investigated whether, as in nerve terminals, the translation machinery was also polarized in oocytes and embryos. Indeed we found that some factors (PAPB) and regulators (phosporylated forms of MnK, 4EBP et S6Kinase…) of translation initiation were co-localized with postplasmic/PEM RNAs associated with the cER (Macho1 and PEM1 RNAs). The fact that regulators such as MnK and S6Kinase change phosphorylation status after fertilization suggests that they control translation initiation of determinants RNAs in the cortex following egg activation.
Résumé / Abstract : Les ascidies (urochordés, espèces Ciona intestinalis et Phallusia mammillata) sont les invertébrés marins les plus proches des vertébrés. Ces organismes se développent en un têtard simplifié (env. 2600 cellules) possédant une notochorde et un système nerveux dorsal. Le modèle ascidie a contribué au début du 20ème siècle à l’émergence de l’idée que l’ovocyte contenait des facteurs localisés déterminant le développement embryonnaire, l’ascidie étant ainsi l’archétype du développement de type mosaïque. Aujourd’hui, nous savons que certains de ces déterminants sont des ARNs maternels corticaux. Ces ARNs font partis d’une grande famille- les ARNs postplasmic/PEM - constituée d’une quarantaine de transcrits classés en Type I (localisés avant fécondation) et Type II (localisés après fécondation). Les ARNs postplasmic/PEM présentent un profil de localisation et de relocalisation corticale très stéréotypé les concentrant dans la région postérieure du zygote et de l’embryon (région du Centrosome Attracting Body : CAB). Le grand nombre d’ARNs corticaux polarisés, la possibilité d’obtenir des embryons synchrones en abondance, d’isoler des fragments corticaux contenant de nombreux ARNs postplasmic/PEM, font du modèle ascidie un modèle de choix pour l’étude de la localisation, de l’ancrage et de la traduction d’ARNs corticaux polarisés. Il était en particulier intéressant d’examiner rigoureusement la classification des ARNs postplasmic/PEM. La différence la plus notable entre ces ARNs corticaux qui se sont tous révélés être localisés avant fécondation (Type I) est leur redistribution dans la partie caudale du têtard. Certains (tel les déterminants Macho1 et PEM1) sont ségrégés uniquement dans 2 petites cellules (B8.11) à destinée somatique, alors que d’autres (tels le marqueur du plasme germinal Vasa) sont également localisés dans 2 autres petites cellules à destinée germinale (B8.12). La région 3’UTR est généralement considérée comme responsable de la localisation et de l’ancrage des ARNs corticaux. Les régions 3’UTR des ARNs postplasmic/PEM comme celles des ARNs localisés de l’amphibien Xenopus étaient connues pour partager de fréquentes répétitions de type xCACx. En recherchant dans l’ensemble des transcrits chez Ciona tous les gènes contenant de telles répétitions à haute fréquence, nous avons confirmé la surreprésentation des ARN postplasmic/PEM dans la catégorie xCACx-riche et avons identifié 2 nouveaux ARNs postplasmic/PEM (MnK et PSD). Nous avons également déterminé les structures d’ancrage corticales des ARNs grâce à des techniques de localisation à très haute résolution (immuno / in situ et microscopie confocale sur œufs et cortex isolés). Ainsi, les ARNs déterminants Macho1 et PEM1 à destinée somatique sont associés à un sous domaine de Réticulum Endoplasmique cortical (REc), alors que les ARNs Vasa, PEM3, POPK à destinée germinale sont associés à des structures granulaires (granules germinaux). Ceci démontre que bien qu’à basse résolution tous ces ARNs semblent partager la même localisation (une fine couche d’un micron sous la membrane plasmique), ils sont en fait associés à différentes structures d’ancrage. Cela nous permet de proposer une nouvelle classification en 2 catégories - le « Type Vasa » associé a des granules et aboutissant dans les cellules B8.11 et B8.12, – « le Type Macho1 » associé au REc dans les B8.11 seulement. Nous avons enfin voulu savoir si, comme dans les terminaisons nerveuses, la machinerie de traduction était aussi polarisée au niveau du cortex des œufs et embryons d’ascidie. Nous montrons que plusieurs facteurs et régulateurs de la machinerie d’initiation de la traduction sont co-localisés avec les ARNs postplasmic/PEM (la PABP, formes phosphorylées de MnK, 4EBP et S6Kinase…) et que certains sont associés sur le REc comme les ARNs Macho1 et PEM1. Le fait que certains des régulateurs de la machinerie d’initiation de la traduction (MnK, S6Kinase…) changent leur statut de phosphorylation après fécondation ouvre de nouvelles perspectives pour comprendre les étapes qui mènent de l’activation de l’œuf à l’initiation de la synthèse localisée des ARNs déterminants.