Étude structurale de métalloprotéines à centres [2Fe-2S]. Cas d’une ferrédoxine et d’une dioxygénase impliquée dans biodégradation des hydrocarbures aromatiques. Cristallographie des protéines à très haute énergie. Méthodes de phasage d’une protéine modele à 55 keV. / Jean Jakoncic ; sous la direction de Yves Jouanneau et Vivian Stojanoff

Date :

Type : Livre / Book

Type : Thèse / Thesis

Langue / Language : français / French

Langue / Language : anglais / English

Métalloprotéines

Ferredoxines

Rayonnement synchrotron

Stojanoff, Vivian (Directeur de thèse / thesis advisor)

Jouanneau, Yves (1955-....) (Directeur de thèse / thesis advisor)

Université Joseph Fourier (Grenoble ; 1971-2015) (Organisme de soutenance / degree-grantor)

Relation : Etude structurale de métalloprotéines à centres [2Fe-2S]. Cas d’une ferrédoxine et d’une dioxygénase impliquée dans biodégradation des hydrocarbures aromatiques. Cristallographie des protéines à très haute énergie. Méthodes de phasage d’une protéine modele à 55 keV. / Jean Jakoncic / Villeurbanne : [CCSD] , 2007

Relation : Etude structurale de métalloprotéines à centres [2Fe-2S]. Cas d'une ferrédoxine et d'une dioxygénase impliquée dans biodégradation des hydrocarbures aromatiques. Cristallographie des protéines à très haute énergie. Méthodes de phasage d'une protéine modele à 55 keV. / Jean Jakoncic ; sous la direction de Yves Jouanneau et Vivian Stojanoff / Lille : Atelier national de reproduction des thèses , 2007

Résumé / Abstract : LES METALLOPROTEINES CONTENANT DES CENTRES FE-S JOUENT UN ROLE IMPORTANT DANS LA NA TURE CAR ELLES SONT IMPLIQUEES DANS DES FONCTIONS PHYSIOLOGIQUES ESSENTIELLES TELLES QUE LA PHOTOSYNTHESE, LA RESPIRATION ET LA FIXATION DE L'AZOTE. DANS CETTE THESE, UNE FERREDOXINE IMPLIQUEE DANS LA BIOGENESE DES CENTRES FE-S, ET UNE DIOXYGENASE BACTERIENNE JOUANT UN ROLE CRUCIAL DANS LA BIODEGRADATION DES HYDROCARBURES AROMATIQUES ONT FAIT L'OBJET D'ANALYSES STRUCTURALES PAR CRISTALLOGRAPHIE AUX RAYONS X. LA STRUCTURE D'UNE FERREDOXINE DE LA BACTERIE PHOTOSYNTHETIQUE RHODOBACTER CAPSULATUS, A ETE RESOLUE DANS LES ETATS OXYDE ET REDUIT. DE PETITS CHANGEMENTS STRUCTURAUX ONT ETE OBSERVES LORS DE LA REDUCTION, NOTAMMENT AU VOISINAGE DU CENTRE [2FE-2S]. CES CHANGEMENTS SONT COMPARES A CEUX DECRITS POUR DES FERREDOXINES DE STRUCTURE SIMILAIRE MAIS DE FONCTION DIFFERENTE. UNE METALLOPROTEINE PLUS COMPLEXE, APPARTENANT A UNE GRANDE FAMILLE DE DIOXYGENASES BACTERIENNES, A ETE ETUDIEE POUR SON ACTIVITE D'OXYDATION DES HYDROCARBURES AROMATIQUES POL YCYCLIQUES (HAP). CETTE ENZYME A TROIS COMPOSANTES, ISOLEE D'UNE SOUCHE DE SPHINGOMONAS DEGRADANT LES HAP COMPREND UNE OXYDOREDUCTASE ANAD(P)H, UNE FERREDOXINE A CENTRE [2FE-2S ET COMPOSANTE OXYGENASE DE SIX SOUS-UNITES ASSEMBLEES EN UN HEXAMERE DE TYPE ALPHA3BET A3. LA COMPOSANTE OXYGENASE, APPELEE PHNI, CONTIENT UNE CENTRE [2FE-2S] DE TYPE RIESKE ET UN ION FERREUX PAR SOUS-UNITE ALPHA,QUI ONT ETE IDENTIFIES PAR LEUR SIGNATURE RPE. L'ENZYME EST DOUEE D'UNE SPECIFICITE DU SUBSTRAT EXTREMEMENT LARGE, PUISQU'ELLE EST CAPABLE D'HYDROXYLE TOUTE UNEGAMME DE HAP FAIT DE 2 A 5 CYCLES AROMATIQUES, Y COMPRIS DES CANCEROGENES COMME LE BENZ[A]ANTHRACENE ET LE BENZO[A]PYRENE. AVEC LE NAPHT ALENE COMME SUBSTRAT, DES MESURES DE CINETIQUE ONT MONTRE QUE CETTE ENZYME A UN KM BAS (0.92 MICRü-MOLE) ET UNE CONSTANTE DE SPECIFICITE DE 2.0 MICRO-MOLE¯¹ SECONDE¯¹. LA PROTEINE PHNI A ETE CRIST ALLISEE, ET SA STRUCTURE 3D, A ETE RESOLUE AVEC UNE RESOLUTION DE 1.85 ANGSTROM. EN DEPIT D'UNE MODESTE SIMILITUDE DE SEQUENCE AVEC DES DlOXYGENASES HOMOLOGUES, LE REPLIEMENT POL YPEPTIDIQUE EST TRES SEMBLABLE. DES DIFFERENCES ONT TOUTEFOIS ETE OBSERVEES AU NIVEAU DE LA POCHE CATAL YTIQUE LES PROTEINES SOUS FORME CRISTALLISEE, NOTAMMENT LES PROTEINES FE-S, PEUVENT SUBIR DES DOMMAGES DUS AU RA YONNEMENT X SYNCHROTRON, CAUSANT DES ARTEFACTS LOR DE LA DETERMINATION DE LA STRUCTURE. POUR ESSAYER DE PALIER CET INCONVENIENT, DES RAYONS X DE TRES HAUTE ENERGIE (55 KEV; 0.22 ANGSTROM), QUI SONT PEU ABSORBES PAR LES PROTEINES, ONT ETE UTILISES POUR RESOUDRE LA STRUCTURE D'UNE PROTEINE MODELE, LE LYSOZYME. UNE STRUCTURE A ETE ETABLIE POUR LA PREMIERE FOIS PAR CETTE APPROCHE, EN UTILISANT LES PHASES EXPERIMENTALES OBTENUES PAR DIFFERENTES METHODES. LES APPLICATIONS POTENTIELLES EN BIOLOGIE STRUCTURALE SONT DISCUTEES.

Résumé / Abstract : METALLOPROTEINS CONTAINING FE-S CLUSTERS PLAY AN IMPORTANT ROLE lN NATURE AS THEY ARE INVOLVED lN ESSENTIAL PHYSIOLOGICAL FUNCTIONS INCLUDING PHOTOSYNTHESIS, RESPIRATION, AND NITROGEN FIXATION. lN THIS THESIS, A [2FE-2S] FERREDOXIN INVOLVED lN FE-S CLUSTER BIOGENESIS, AND A BACTERIAL DIOXYGENASE PLAYING A CRITICAL ROLE lN AROMATIC HYDROCARBON BIODEGRADATION WERE SUBJECTED TO STRUCTURAL ANALYSIS BY SYNCHROTRON X-RA Y CR YSTALLOG RAPHY. THE STRUCTURE OF A FERREDOXIN FROM THE PHOTOSYNTHETIC BACTERIUM RHODOBACTER CAPSULATUS WAS SOLVED lN BOTH ITS OXIDlZED AND REDUCED STATES. SUBTLE STRUCTURAL CHANGES WERE OBSERVED UPON REDUCTION, ESPECIALLY lN THE VICINITY OF THE [2FE-2S] CLUSTER. THESE CHANGES ARE DISCUSSED lN COMPARISON WITH THOSE DESCRIBED FOR FERREDOXINS WITH SIMILAR STRUCTURES BUT DIFFERENT FUNCTIONS. A MORE COMPLEX METALLOPROTEIN, BELONGING T0 A LARGE FAMILY OF BACTERIAL DIOXYGENASES, WAS STUDIED FOR ITS ABILITY TO OXIDIZE POL YCYCLIC AROMATIC HYDROCARBONS (PAHS). THIS MULTICOMPONENT ENZYME, ISOLATED FROM A PAH-DEGRADING SPHINGOMONAS STRAIN, CONSISTS OF A NAD(P)H-OXIDOREDUCTASE, A [2FE-2S] FERREDOXIN, AND A TERMINAL OXYGENASE . THE TERMINAL OXYGENASE COMPONENT, CALLED PhnI, CONSISTS OF SIX SUBUNITS ASSEMBLED INTO AN ALPHA3B ET A3 HEXAMER, AND CONTAINS ONE RIESKE-TYPE [2FE-2S] CLUSTER AND ONE FE(II) ION PER ALPHA SUBUNIT, WHICH WERE IDENTIFIED BY THEIR CHARACTERISTIC EPR SIGNATURE. THE ENZYME SHOWED AN EXCEPTIONALLY BROAD SUBSTRATE SPECIFICITY, AS IT COULD HYDROXYLATE A WIDE RANGE OF PAHS MADE OF TWO TO FIVE FUSED RINGS, INCLUDING THE CARCINOGENS, BENZ[A]ANTHRACENE AND BENZO[A]PYRENE WlTH NAPHTHALENE AS SUBSTRATE, STEADY STATE KINETICS SHOWED TH AT THE ENZYME HAD A LOW APPARENT KM (092 MICRO-MOLE) AND A SPECIFICITY CONSTANT OF 2.0 MICRO-MOLE¯¹. SECOND¯¹. THE PHN1 PROTEIN WAS CRYSTALLIZED AND ITS THREEDIMENSIONAL STRUCTURE WAS DETERMINED AT 1.85 ANGSTROM RESOLUTION. lN SPITE OF MODERATE SEQUENCE SIMILARITY WITH HOMOLOGOUS DIOXYGENASES, THE 3D POL YPEPTlDE FOLD W AS FOUND TO BE VER Y SIMlLAR, MOST OF THE DIFFERENCES BEING OBSERVED NEAR THE SUBSTRATE BINDING POCKET. MANY PROTEIN CR YSTALS, ESPECIALLY THOSE OF FE-S PROTEINS, HAVE BEEN SHOWN TO UNDERGO X-RA Y RADIATION DAMAGE, LEADING TO ARTIFACTS lN PROTEIN STRUCTURE DETERMINATIONS. AS AN ATTEMPT TO SOLVE THE PROBLEM, ULTRA-HIGH ENERGY X-RA YS (55 KEY: 0.22 ANGSTROM), WHICH ARE ONLY SLlGHTLY ABSORBED BY PROTEINS, WERE USED FOR THE FIRST TIME TO DETERMINE THE 3 D STRUCTURE OF A MODEL PROTEIN? LYSOZYME. BEAMLINE SPECIFITIES AS WELL AS OPTIMUM ENERGY WERE DETERMINED. POTENTIAL APPLICATIONS FOR STRUCTURAL BIOLOGY ARE DISCUSSED.