Date : 2006
Editeur / Publisher : [S.l.] : [s.n.] , 2006
Type : Livre / Book
Type : Thèse / ThesisLangue / Language : français / French
Résumé / Abstract : Longtemps considéré comme toxique, le sélénium est aujourd'hui reconnu comme essentiel. Admise comme le 21ème acide aminé, la sélénocystéine (acide aminé U ou Sec) représente la forme biologique majeure du sélénium et constitue une exception à la règle universelle du code génétique. En effet, le codon spécifique de la Sec est UGA, habituellement lu comme signal de terminaison de la traduction. Les sélénoprotéines ainsi produites sont des enzymes impliqués majoritairement dans des processus d'oxydo-réduction et de défense contre les radicaux libres. Elles ont aussi été découvertes impliquées dans un grand nombre de pathologies telles que certaines myopathies, le cancer ou l'infertilité masculine.La première partie de ce travail de thèse a porté sur l'étude de deux partenaires de l'incorporation de la sélénocystéine dans les protéines. Chez les eucaryotes, la protéine SBP2 et l'ARN SECIS (tige-boucle de l'ARNm située dans la région 3' non traduite) font partie d'une machinerie complexe permettant la reprogrammation du codon UGA Sec. En vue de la cristallisation de ce complexe, différentes constructions de la protéine et de l'ARN ont été utilisées. Des protocoles d'expression et de purification permettant d'obtenir les macromolécules en quantité ont été mis au point. Malgré le criblage de plusieurs milliers de conditions, il n'a pas été possible d'obtenir de cristaux, ni de complexe, ni de la protéine seule. La caractérisation biophysique de la protéine SBP2 par diffusion de lumière, ultracentrifugation analytique et RMN a révélé une absence de structuration. Dans les mécanismes moléculaires permettant la synthèse des sélénoprotéines, le complexe SBP2/ARN SECIS agit comme une plateforme pour le recrutement d'autres facteurs qui pourraient être nécessaires à la stabilisation de la protéine SBP2. Certains n'ont pas encore été identifiés. Une autre hypothèse serait que la destructuration de SBP2 soit nécessaire pour son activité biologique comme cela est le cas d'autres protéines intrinsèquement non structurées.La deuxième partie, complètement indépendante, a consisté à étudier les dommages causés par les rayons X sur un cristal de macromolécule biologique pendant une collecte de données cristallographiques. Les modifications structurales engendrées peuvent parfois rendre le phasage et donc la résolution de la structure impossibles. Le suivi de ces dommages sur un cristal d'ARN bromé par l'enregistrement de spectres de fluorescence X au cours d'une collecte de données a été le principal objectif de ce travail. Nous avons observé une modification systématique des spectres de fluorescence se corrélant bien avec la dose cumulée de rayons X provoquant la coupure de la liaison C-Br. Une conséquence pratique est que, par une simple différence entre un spectre quelconque et celui mesuré sur une solution de NaBr (100 % de brome libre), on obtient une excellente estimation du pourcentage de brome encore lié. Ces mesures supplémentaires pourraient permettre d'ajuster l'intensité du faisceau et d'évaluer l'occupation restante à tout moment au cours de la collecte, ceci afin d'améliorer le phasage par la méthode RIP (Radiation-damage-Induced Phasing).
Résumé / Abstract : Selenium, long considered as a potent toxic substance, is actually necessary for the function of all cells in (probably) all living organisms. Selenocysteine (Sec, U), now widely considered as the 21st amino acid, is the major biological form of selenium. This particular amino acid is specifically incorporated into selenoproteins through a dedicated translation machinery that constitutes an exception to the universal genetic code. Unlike other amino acids, its insertion into proteins (named selenoproteins) requires a translational recoding event that occurs at select UGA codons, which usually signal translation termination. There are 25 selenoproteins identified in human. Whereas most of them have not been attributed a function yet, their implications in a large number of pathologies such as myopathies, cancer or in fertility have been demonstrated.This work focused on the understanding of this atypical incorporation of selenocysteine into proteins. In eukaryotes, SBP2 protein and SECIS RNA (a stem-loop structure in the mRNA located in the 3'-UTR) are two essential factors that allow reprogrammation of the UGA stop codon. In order to visualize their interactions, we have tried to cristallize the complex by using various SECIS RNA sequences and different truncated forms of the SBP2 protein. Expression and purification protocols have been set up and reasonable amounts of macromolecules have been obtained. Besides the screening of thousands of conditions, no crystal has grown. Biophysical characterization by diffusion light scattering, analytical ultracentrifugation and 1D NMR have revealed a lack of structuration of the protein. In fact, in order to allow the synthesis of selenoproteins, SBP2/SECIS RNA complex would act as a platform to recruit other factors that might be needed for the stabilization of SBP2. Some of those factors are still to be discovered. Another hypothesis would be that the non-folded domains of SBP2 are required for its biological function as it is the case for other intrinsically unstructured proteins.The second part of this thesis work, completely independent, aimed at studying the damage to cryo-cooled macromolecular crystals caused by intense X-ray flux. Radiation damage events that affect anomalous scatterers can actually prevent structure determination. We have used fluorescence spectra to monitor radiation damage during data collection on brominated RNA crystals. This type of spectrum is the one usually recorded before a MAD experiment. Collected consecutively or during data collection at regular intervals, we observed modifications of the spectra that are correlated with C-Br bonds cleavage caused by X-rays. They also yielded a good estimate of bromine occupancy over the time of the experiment. These results will be useful to optimize what is now known as the RIP method (Radiation-damage-Induced Phasing) exploiting both anomalous signal of an anomalous scatterer and the 'isomorphous' signal resulting from the X-ray damage.