Date : 2005
Editeur / Publisher : [S.l.] : [s.n.] , 2005
Type : Livre / Book
Type : Thèse / ThesisLangue / Language : français / French
Langue / Language : anglais / English
Résumé / Abstract : La polarité est une caractéristique fondamentale des cellules épithéliales ou neuronales qui régit de très nombreuses fonctions biologiques. Dans les cellules différenciées comme les cellules épithéliales, cette polarité est matérialisée par trois domaines membranaires distincts : les domaines apicaux, latéraux et basaux dont les compositions lipidique et protéique sont différentes. Les jonctions serrées séparent le domaine apical du domaine latéral ; en empêchant les protéines et les lipides de diffuser d'un domaine à l'autre, elles contribuent au maintien de la polarité cellulaire. Elles forment d'autre part une barrière sélective régulant le passage de molécules à travers l'espace paracellulaire. Les jonctions serrées forment un échafaudage macromoléculaire complexe composé de protéines membranaires et cytoplasmiques liées au cytosquelette d'actine sous-jacent. Elles participent au maintien de l'adhérence cellule-cellule, au contrôle de la prolifération, de la différenciation et de la polarité cellulaire. ARF6 (ADP-ribosylation factor 6) appartient à la famille des petites protéines G monomériques de type Ras et son rôle dans l'endocytose et dans les réarrangements du cytosquelette d'actine est bien établi. ARF6 fonctionne à la manière d'un interrupteur biologique cyclant successivement entre un état dit inactif (catalysé par une protéine GTPase nommée GAP) et un état dit actif (catalysé par un facteur d'échange, GEF). Dans ce travail, nous avons établi que le facteur d'échange d'ARF6 participe à la régulation des réarrangements du cytosquelette d'actine requis pour la mise en place des jonctions serrées et plus généralement pour l'établissement de la polarité cellulaire. Cette régulation nécessite (1) la catalyse de l'échange GDP-GTP sur ARF6 et (2) un domaine spécifique du facteur d'échange, le domaine C-terminal, impliqué dans les réarrangements du cytosquelette d'actine indépendamment de son activité d'échange sur ARF6. Mon but était de mieux comprendre le rôle d'ARF6 dans ce processus. Or, ARF6 étant impliquée dans le trafic membranaire et dans la réorganisation de l'actine, il fallait déterminer la contribution de ces deux fonctions dans la mise en place des jonctions. Sur la base des études structurales et biochimiques d'ARF6, j'ai donc construit différents mutants d'ARF6 que j'ai exprimés de manière inductible dans des cellules épithéliales polarisées ; j'ai aussi établi une lignée inductible me permettant d'inhiber l'expression d'ARF6 via la technique du RNA interférence. J'ai étudié les propriétés biochimiques des mutants in vitro et observé leurs effets sur la morphologie, le trafic intracellulaire de récepteurs membranaires et dans la mise en place des jonctions serrées. Les études montrent que le cycle GDP-GTP d'ARF6 est important pour qu'ARF6 joue son rôle que ce soit dans le recyclage de protéines internalisées via une voie indépendante de la clathrine ou dans la mise en place des jonctions serrées. Cependant, ARF6 est nécessaire mais pas suffisant ; la réorganisation du cytosquelette d'actine et la mise en place des jonctions serrées nécessitent la coopération entre le domaine C-terminal du facteur d'échange d'ARF6 et le cycle d'ARF6.
Résumé / Abstract : Polarity is a fundamental characteristic of epithelial and neuronal cells and is critical for various biological functions. In differentiated cells, like epithelial cells, plasma membranes are functionally divided into apical, lateral and basal membrane domains which differ in the compositions of integral membrane proteins and lipids. Tight junctions look like a fence in the most apical part of the lateral membrane and are probably the morphological counterpart of a localized diffusion barrier. Moreover, they seal the intercellular space between adjacent cells to prevent the diffusion of solutes through this intercellular space. The transmembrane proteins constituting these tight junctions are linked to components of the cytoskeleton and establish maintenance of adhesion between neighboring cells. In addition, a growing number of cytoplasmic scaffolding proteins associated with these junctions are involved in regulating diverse processes such as transcription, cell proliferation and cell polarity. ARF6 (ADP-Ribosylation Factor 6), a member of the ARF family of Ras-related small G proteins, regulates endocytosis between the plasma membrane and endosomal compartments in non-polarized cells and initiates cortical actin rearrangements at the cell periphery. ARF6 cycles between two conformational states: an inactive GDP- and an active GTP-bound state. The GDP/GTP exchange is controlled by guanine nucleotide exchange factor proteins (GEF) and the hydrolysis of GTP controlled by GTPase activating proteins (GAP). In this work, we established that the exchange factor for ARF6 stimulates the polarized rearrangement of the actin cytoskeleton during the establishment of tight junction and cell polarity. This regulation requires the coordinated action of the catalytic domain of the exchange factor to promote ARF6 activation and its C-terminal region to control actin cytoskeletal reorganization. My goal was to better understand ARF6 contribution in this function. Indeed, ARF6 is involved in plasma membrane/endosomes trafficking and cortical actin reorganization: so what are the contributions of these two functions in tight junction formation? Structural and biochemical studies of ARF6 led me to construct ARF6 mutants stably expressed in epithelial cells under the control of a tetracycline-repressible transactivator. I also established an inducible cell line with a ARF6 siRNA to reduce ARF6 expression. I studied biochemical properties of these mutants and observed their effects on cell morphology, intracellular trafficking of membrane receptors and in formation of tight junction. Results show that ARF6 GDP-GTP cycle is important for ARF6 function in recycling of proteins internalized in a clathrin-independent pathway and in formation of tight junction. However, ARF6 is necessary but not sufficient: actin reorganization and tight junction formation require the coordinated action of the C-terminal domain of the exchange factor of ARF6 and ARF6 cycling.