Date : 2002
Editeur / Publisher : [S.l.] : [s.n.] , 2002
Type : Livre / Book
Type : Thèse / ThesisLangue / Language : français / French
Résumé / Abstract : Nous avons étudié l'activité de l'ARN polymérase du bactériophage T7 sur l'ADN de T7par microscopie de fluorescence à l'échelle de la molécule individuelle. Nous avons immobilisé et étiré l'ADN par peignage moléculaire et utilisé cet ADN comme matrice pour l'activité de l'enzyme. Nous avons montré que la transcription d'une molécule d'ADN fixée et étirée par peignage moléculaire n'est pas possible à cause de la sur-extension de l'ADN. Par contre en réduisant l'extension moléculaire de l'ADN par peignage, sous faible tension de surface, l'ARN polymérase retrouve une activité avec des caractéristiques proches de celles observées habituellement in vitro : nécessité de la présence du promoteur de T7 pour le démarrage et possibilité d'immobilisation de l'ARN polymérase sur son promoteur. Nous avons vérifié que les molécules d'ARN sont accessibles à des protéines diffusant en solution. Dans un second temps nous avons pu suivre directement l'ARN polymérase, une fois couplée à un marqueur colloi͏̈dal fluorescent. Nous avons pu observer les étapes essentielles de l'activité de transcription de l'ARN polymérase : la diffusion et la reconnaissance du promoteur par l'enzyme ainsi que le mouvement processif de l'ARN polymérase le long de l'ADN peigné. Ces résultats préliminaires sont prometteurs mais ont mise en évidence certaines limites du peignage moléculaire. Cela nous a conduit à développer une nouvelle méthode d'étirement de l'ADN, alternative au peignage moléculaire, plus complexe mais potentiellement plus adaptée pour l'observation d'interactions ADN-protéines : l'alignement de l'ADN sur une lamelle lithographiée.