Date : 2001
Type : Livre / Book
Type : Thèse / ThesisLangue / Language : français / French
Résumé / Abstract : Nous avons étudié les fonctions d'une protéine pro-apoptotique de la famille Bcl-2, par son expression hétérologue dans la levure S. cerevisiae. La levure ne possède aucun gène homologue à Bcl-2, et s'avère être un outil adapté pour tester les fonctions de Bax. Comme pour les mammifères, Bax tue la levure et provoque un relargage du cytochrome c vers le cytosol. La coexpression de Bcl-xL réverse ces phénotypes. Tout d'abord nous avons voulu caractériser l'adressage de Bax à la mitochondrie. Nous montrons que le domaine C-terminal n'est pas responsable de l'adressage à la mitochondrie et n'intervient pas dans la fonction de relargage du cytochrome c. Nous confirmons que cette fonction dépend étroitement de la structure du domaine C-erminal. En fait, l'expression de Bax natif ne s'accompagne d'aucun phénotype à moins que la structure du domaine C-terminal soit perturbée. Nous confirmons que Bax nécessite un changement conformationnel pour être actif. Ensuite, nous nous sommes intéressés à la cytotoxicité de Bax. Nous avons testé divers partenaires potentiels dans la mitochondrie : deux protéines supposées faire partie du PTP sont facultatives pour la cytotoxicité de Bax. Le fonctionnement de la chaîne respiratoire et les oxydations phosphorylantes sont aussi facultatifs. Le seul partenaire identifié est le cytochrome c, mais sa présence n'est pas indispensable non plus à l'effet létal de Bax. Nous avons identifié un partenaire non protéique : l'oxygène. L'expression de Bax produit un stress oxydatif qui pourrait être responsable de la toxicité de Bax par la peroxydation lipidique produite. Enfin, nous avons enfin testé la capacité de Bax à former des canaux dans les membranes biologiques. Nos expériences de patch-clamp caractérisent un nouveau canal de grande conductance dans les MOM d'une souche dépourvue de porine exprimant Bax. Une activité identique a été confirmée chez les mammifères. Ce canal pourrait permettre le passage du cytochrome c.
Résumé / Abstract : We investigated here the functions of a pro-apoptotic member of the Bcl-2 family through heterologous expression in yeast S. cerevisiae. Yeast has no Bcl-2 related gene, and thus turns out to be a relevant tool to test pro-apoptotic human Bax functions. As in mammals, Bax kills yeast cells and triggers the relocalisation of the cytochrome c to the cytosol in a Bcl-xL sensitive manner. One of the goals of this thesis was to understand Bax targeting to mitochondria. We evidenced that the putative C-terminal transmembrane domain is either a signal anchor sequence, nor required for Bax-mediated cytochrome c release. We also confirmed that Bax cytochrome-c-releasing ability is highly dependent on the structure of its C-terminal part. In fact, expression of native Bax had no phenotype at all, unless the C-terminal part was modified. Yeast thus proved to be a powerful tool to confirm that Bax needs to be activated by a conformational change to exhibit its characteristic phenotypes. Another goal was the investigation of Bax cytotoxicity. We assayed the functional partnership between Bax and mitochondrial proteins : proteins that are thought to be components of the mammalian PTP ar not required for Bax cytotoxicity. We also demonstrated that neither respiratory chain, nor oxidative phosphorylations are required for Bax lethal effect. Cytochrome c was the only functional partner we identified, but its presence is not essential to Bax-mediated cell death. We identified another partner that was oxygen : Bax expression produces an oxidative stress that could account for its cytotoxicity through lipid peroxidation. Finally, we next tested the ability of native Bax to form channels in biological membranes. Patch-clamp experiments evidenced a new large conductance channel in MOM upon Bax expression in a VDAC-less strain. Such an activity was confirmed in mammals. This activity could be compatible with a cytochrome c releasing function.